Ви є тут

Чутливість нормальних та малігнізованих лімфоцитів до світлового випромінювання видимої ділянки спектру

Автор: 
Прокопенко Ігор Вікторович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U002909
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Одержання лімфоїдних клітин

2.1.1. Одержання мононуклеарів
У дослідах використовувались лімфоцити, отримані з гепаринізованої периферичної крові здорових донорів- добровольців, та лімфоконцентрату, отриманого з крові хворих на В-клітинний лімфолейкоз.
Для виділення мононуклеарів використовували загальноприйнятий метод швидкого виділення шляхом центрифугування цільної крові в градієнті густини [99]. Цільну гепаринізовану донорську кров розводили в два рази середовищем Хенкса, забуференим 0,1 М фосфатом натрію рН 7,2 (ЗХ), обережно нашаровували в центрифужних пробірках на розчин фікол - верографіну (густина 1,078 кг/м3), та центрифугували 20 хв. при кімнатній температурі 3500 об/хв.(близько 2000 g). Після закінчення центрифугування еритроцити і гранулоцити розташовуються на дні пробірки, а на кордоні розділу фаз знаходяться мононуклеарні клітини. Останні акуратно відбирали шприцем із довгою голкою, відмивали ЗХ та осаджували центрифугуванням. Процедуру повторювали тричі. За морфологічними критеріями, більше ніж 80% клітин ідентифіковано як лімфоцити, забруднення тромбоцитами не перевищувало 0,1%.

2.1.2. Виділення Т- та В - лімфоцитів
Приблизно 70% клітинної суспензії мононуклеарів складають Т-лімфоцити. При інкубації суспензії в пластикових чашках Петрі відбувається адгезія моноцитів на полістироловій поверхні. Подвійна інкубація суспензії протягом 30 хв кожна при 370С в атмосфері з 5% СО2 давала практично повну очистку супернатанта від моноцитів. Від тромбоцитів звільнялися в два етапи: спочатку плазму видаляли; потім центрифугуванню 1000 об./хв протягом 3 хв. піддавали мононуклеарну суспензію після видалення моноцитів [100]. Для очистки даної фракції від В-клітин використовують фільтрацію суспензії на нейлоновій ваті, якою набивають циліндр від шприця об'ємом 5 - 10 мл (на кінчик одягають силіконову трубку із зажимом). Зрівноважують колонку буферним розчином при 370C протягом 30 хв, промивають двома об'ємами буферу, та наносять суспензію клітин (близько 108 клітин/мл середовища, що включає 5% БСА); після поглинання суспензії, на вату наносять 0,5 мл буферного розчину для змиву клітин, які сіли на стінки циліндру; колонку герметизують. Через 30-40 хв інкубації при 370С клітини знімають з колонки, використовуючи елюцію 20 мл буферного розчину зі швидкістю приблизно 1 крапля/с.
В основу методу виділення В - лімфоцитів покладена здатність поверхні деяких видів пластика адсорбувати білки, зокрема антитіла, з частковим збереженням антиген-зв'язуючої активності. Змішану лімфоцитарну суспензію вносять до полістирольної чашки Петрі і залишають для седиментації на дно, покрите анти-Ig. В результаті антиген-позитивні клітини зв'язуються з пластиком, а антиген-негативні легко видаляються шляхом змиву клітинної суспензії [101].

2.2. Методи Е- та М-розеткоутворення
Молекули Т-лімфоцитів мають на поверхні мембрани антигени CD-2, з якими зв'язуються еритроцити барана, утворюючи розетки, підрахунок яких здійснюється під мікроскопом.
Згідно описаної процедури Е- розеткоутворення [102], на середовищі Хенкса, забуференому 0,1 М фосфатом натрію при рН 7,2 (ЗХ), готували 0,5% розчин еритроцитів барана. Свіжовиділені лімфоцити людини змішували із цим розчином у пропорції еритроцити/лімфоцити = 50/1 та розділяли на 2 частини - дослідну і контрольну. Дослідну частину піддавали лазерному опромінюванню (лазер ЛГ-111, щільність вихідної потужності 0,5 Вт/м2, експозиція 60 с). Далі обидві порції (і дослідну, і контрольну) інкубували в термостаті протягом 10 хв при t= 370C, після чого осаджували центрифугуванням 1000 об./хв протягом 3 хв. Супернатант відбирали, до клітинного осаду доливали розчин глютаральдегіду до кінцевої концентрації 0,06%, з допомогою якого фіксували клітини протягом 20 хв при кімнатній температурі. Після фіксації глютаральдегід відбирали, клітини тричі відмивали ЗХ; останній раз їх ресуспендували в 0,3 мл. Із кожної пробірки суспензію зливали на предметне скло, де мазки висихали. Фарбування: 50 мл Н2О дистиляту + 47 крапель профільтрованого реактиву Май - Грюнвальда; процес розвивається протягом 50 хв.
Реакція М-розеткоутворення ідентична наведеній тут, за
виключенням того, що використовуються еритроцити миші, які реагують із антигеном CD-19 - маркером В-лімфоцитів.

2.3. Виділення фотореактивного білку із
суспензії лімфоцитарних клітин

2.3.1. Теплова обробка суспензії клітин

Суспензію лімфоцитів відмивали та ресуспендували в ЗХ; процес відмивання повторювали, після чого суспензію доводили до концентрації 10 млн клітин/мл, та інкубували, перемішуючи, у водяному термостаті (60 хв. при 450С). Після інкубації суспензію клітин центрифугували 5хв. при 1000 g. Клітини переходили в осад. В супернатанті залишався білок, знятий з клітинної поверхні.

2.3.2. Обробка поверхні лімфоцитарної
мембрани детергентом
Альтернативний підхід до зняття білка з клітинної мембрани був запропонований Dziarsky [103] і полягав у використанні неіонного детергента октилглюкозиду (n-октил-?-D-глюкопіранозиду) для нецитотоксичного звільнення мембранних білків з поверхні інтактних лімфоцитів. До клітинної суспензії (10 млн/мл) вносили октилглюкозид та розчиняли до кінцевої концентрації 0,1% (вага/об'єм) і інкубували 30 хв при кімнатній температурі при легкому перемішуванні. Потім клітини осаджували центрифугуванням при 1000 об/хв на протязі 3 хв; в розчині залишався білок, знятий з лімфоцитарної мембрани.
2.3.3. Концентрування фотореактивного білку
Після завершення процедури зняття білку з лімфоцитарної мембрани супернатант відбирали, переносили до діалізного мішка (розміри пор якого дозволяють затримувати білки із молекулярною масою, більшою за 12 кДа) та діалізували проти 2 л дистильованої води протягом 3 год. Далі мішок із зразком переносили до 8%-го водного розчину поліетиленгліко