Ви є тут

Вплив пестицидного забруднення водного середовища на іхтіологічні показники та метаболічні перетворення в організмі коропа

Автор: 
Мехед Ольга Борисівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U003042
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єктом дослідження слугував короп (Cyprinus carpio L.) різного віку (личинка, мальок, цьогорічка, дворічка).
Риб відбирали з природної водойми (зимувальний ставок Чернігівського рибокомбінату). Протягом усього періоду досліджень (1998-2004 роки) гідрохімічний режим води контролювався за допомогою приладу Horiba моделі U-7 (Японія). Вміст кисню у воді ставків коливався в межах 9,6-12,5 мг/л; рН - 7,4-8,4; вміст аміаку - 0,014 мг/л. Вказані умови не викликали розвиток в організмі коропа гіпоксії, гіперкапнії, гіпотермії. За даними іхтіопатологічних спостережень на рибах нашкірних збудників паразитичних хвороб не виявлено. Стрічкових паразитів також не зафіксовано.
Досліди з вивчення впливу пестицидів проводили в 200-літрових акваріумах з відстояною водопровідною водою, в які рибу розміщували з розрахунку 1 екземпляр на 40 л води. В усіх випадках здійснювали контроль і підтримували постійний гідрохімічний режим води. Величина рН складала 7,30±0,27; вміст кисню - 5,6±0,4 мг/л, температуру витримували близькою до природної в залежності від пори року. Дослідження проводили протягом року. Маса риб коливалась в межах 200-250г для дворічок та 100-150г для цьогорічок.
Концентрацію досліджуваних пестицидів (0,2 мг/дм3, що відповідає 2 ГДК для 2,4-Д амінної солі) створювали шляхом внесення розрахункових кількостей 10%-ної кристалічної 2,4-Д кислоти (2,4-Д), 40%-ного водного розчину 2,4-Д-амінної солі (2,4-ДА) і розчину 2,4-Д бутилового естеру у льодяній оцтовій кислоті. Концентрація зенкору становила 0,2 мг/л (2 ГДК) і досягалась внесенням 70%-ного порошку зенкору. При дослідженні дії гербіцидів сумісно з низькими температурами води температурний режим підтримували штучно завдяки додаванню льоду.
Для визначення кількісного накопичення гербіцидів в організмі коропа використовували білі м'язи, печінку, головний мозок, зябра та кишечник риб. Очистку екстрактів тканин проводили згідно методики [149], кількісне визначення гербіцидів групи 2,4-Д в органах та тканинах риб, а також визначення залишкових кількостей пестицидів у воді проводили по методикам [109, 110]. Визначення вмісту зенкору виконували за методичними вказівками [88].
Кількісний аналіз вільних амінокислот здійснювали приготуванням гомогенатів наважок тканин головного мозку, печінки та білих м'язів у співвідношенні 1:5 (масса : об'єм) в охолодженій 6% хлорній кислоті, які потім нейтралізували до рН=7,0 0,25М розчином калій карбонату, центрифугували і випаровували досуха. Осад розчиняли в 0,1 мл 0,1 н розчину хлоридної кислоти. Аліквотні частини наносили на хроматографічний папір (Ленінградська середня). Висхідну хроматографію проводили в системі розчинників бутанол : оцтова кислота : вода в співвідношенні: 1-й розчинник - 12:3:5 [166], 2-й розчинник - 40:15:5 [166, 114], для чіткого виділення гліцину використовували систему розчинників, описаних в роботі Починок Х.П. [118]. Кількість вільних амінокислот в тканинах контролювали за допомогою амінокислотного аналізатора ААА 881 ЧФРЮ за методикою, описаною у додатку до прибору.
Вміст глюкози визначали фотометричним методом, вимірюючи інтенсивність кольорової реакції з о-толуїдиновим реактивом [41].
Визначення вмісту макроергічних сполук (ATФ, ADФ, AMФ) в тканинах риб здійснювали, керуючись рекомендаціями Маляревської А.Я. та Білик Т.І. [83]. Заморожені в рідкому азоті тканини подрібнювали в порошок, з якого потім робили наважки для визначення зазначених макроергічних сполук. Нуклеотиди екстрагували 8%-ним розчином хлорної кислоти у співвідношенні маси тканини до об'му розчинника 1:1, 20-40 хвилин при охолодженні. Білки осаджували центрифугуванням також при достатньому охолодженні (1-2?С). Надосадові рідини після осадження білків використовували для одержання нейтрального екстракту. Нейтралізацію проводили на холоді охолодженим 2 М розчином К2СО3.
Нейтральні екстракти з тканин, а також стандартні розчини ATФ, ADФ, AMФ (свідки) наносили на пластинку "Силуфол" UV-VIS 254 (ЧССР), висушуючи плями в потоці холодного повітря. Розділення здійснювали при кімнатній температурі у скляній хроматографічній камері, попередньо насиченій парами розчинників, в системі 1,4-діоксан : ізопропанол : аміак : вода (4:2:1:4) [61]. Аденіннуклеотиди на хроматограмі після її висушування, виявляли за допомогою УФ-опромінювання при 260 нм. Для кількісного визначення плями вирізали та елюювали 1 год. в 0,1 н хлоридній кислоті. Екстинцію отриманих розчинів вимірювали на спектрофотометрі при 260 нм проти відповідного контролю.
Вміст нуклеотидів на 1 г сирої маси тканини визначали за формулою:
С=*1000, де
С - вміст аденіннуклеотиду в мікромолях на 1 г сирої маси;
Е - екстинція досліджуваного розчину;
V1 - об'єм 0,1 н хлоридної кислоти, взятої для елюції;
V2 - об'єм нейтрального екстракту;
V3 - об'єм 8% хлорної кислоти, який використовувався для екстракції;
V4 - об'єм проби, яку наносили на пластинку;
m - маса тканин;
K - коефіцієнт молярної екстинції, рівний за наших умов (260 нм, рН=2) 14,3*103 (для АТФ), 14,5*103 (для ADФ, AMФ) [137].
Для оцінки участі АТФ, АДФ, АМФ в метаболічній регуляції було розраховано аденілатний енергетичний заряд [69, 167]:
АЕЗ=,
та відношення діючих мас аденілаткіназної реакції [31]:
ДМ АК =.
Після нейтралізації і центрифугування хлорні екстракти використовували для визначення вмісту лактату і пірувату ферментативним методом [89]. Відновлені форми визначали у гідразин-гліциновому буфері, а окислені - у 0,5М триетаноламіновому буфері при 340 нм.
Кетокислоти визначали кількісно гідразиновим методом, використовуючи тонкошарову хроматографію як описано в роботі І.В.Лисняк [71].
З метою визначення активності ферментів гомогенат тканин готували на 0,25М сахарозі у співвідношенні 1:10. Ядра, мітохондрії та мікросоми виділяли за загальноприйнятими методиками [228] з урахуванням деяких особливостей