РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення мети і завдань, поставлених у дисертаційній роботі, виходячи з сучасних уявлень про епідеміологію і патогенез генітального герпесу, принципів його лікування і профілактики, застосували відповідний комплекс клініко-лабораторних методів дослідження.
Для діагностики РГГ та оцінки ефективності лікування, крім загальноприйнятих методів дослідження використовували метод імуноферментного аналізу (ІФА) сироватки крові та полімеразну- ланцюгову реакцію (ПЛР) сироватки крові та слизу цервікального каналу. До і після лікування через 3 і 6 місяців у сироватці крові хворих методом ІФА визначали рівень Ig М і Ig G до антигену ВПГ, мікоплазменної та уреаплазменної інфекції, ПЛР. У сироватці крові і слизу цервікального каналу проводили ідентифікацію специфічної ланки молекули ДНК-вірусу, в сироватці крові - мікоплазменної і уреаплазменної інфекції. У крові досліджували загальну кількість лімфоцитів, Т-лімфоцитів, рівень Ig М, Ig G, Ig А, вміст активних лімфоцитів і визначали фагоцитарне число. Забір крові для дослідження проводили натще із ліктьової вени в кількості 7-8 мл.
Для виявлення ВПГ-ІІ в крові хворих використовували метод ІФА, який базується на феномені антиген + антитіло і виконується за допомогою рідиннофазової та твердофазової методологій. Для твердофазного ІФА були використані тести "ІнтипоСоmв 11" (фірми Orgenics, Ізраїль, сертифікат про державну реєстрацію імунобіологічного препарату № 78/97 - 3002 3900 03.11.97).
Рідиннофазова ІФА діагностика проводилась за допомогою діагностичних імуноферментних тест-систем"Векто ВПГ - Ig M - стрип" (Д - 2154), "Векто ВПГ - Ig G - стрип" (Д - 2152), "Мікоплазма Бест - Ig G - стрип" (Д - 2256), "Уреаплазма Бест - Ig G - стрип" (Д - 2254) виробництва Росії, Федеральна ліцензія № 42/055/2001 на виготовлення, зберігання та реалізацію лікарських засобів.
Для визначення Ig М та Ig G до ВПГ-І, ВПГ-ІІ, Ig G до мікоплазми та уреаплазми на першій стадії аналізу контрольні зразки інкубували імобілізованими антигенами ВПГ-І, ВПГ-ІІ мікоплазми і уреаплазми. Антитіла до збудника з'єднувались з імобілізованим антигеном. Матеріал, який не зв'язався, видаляли відмиванням [126]. Імуноглобуліни, які зв'язались, виявляли при інкубації з кон'югатом анти-Ig M та антитіл до Ig G людини з пероксидазою хрону. Після другої відмивки кількість кон'югату, який зв'язався, визначали кольоровою реакцією з використанням субстрату пероксидази - перекису водню та хромогену - тетраметилбензидину. Реакцію зупиняли додаванням розчину сірчаної кислоти та вимірювали оптичну щільність (ОЩ) розчину в лунках при довжині хвилі 450 нм. Норма ОЩ у контрольній групі Ig M до антигену ВПГ - 0,4 нм, Ig G - 0,24-0,40 нм.
Виявлення у сироватці крові жінок Ig M та Ig G до антигену ВПГ, мікоплазменної та уреаплазменної інфекції свідчить про наявність захворювання, викликаного відповідними збудниками. Для цього, дотримуючись правил асептики і антисептики, проводили забір венозної крові 1-1,5 мл натщесерце в стерильну пробірку. Шкребок з цервікального каналу здійснювали з допомогою спеціальних одноразових стерильних зондів типу Corvex brush або Voba-brush, які мали вигляд йоршика. Це давало змогу отримувати велику кількість клітинного матеріалу з досліджуваної ділянки. Спочатку видаляли слиз з шийки матки з допомогою стерильного ватного тампону, після чого вводили йоршик на глибину 0,5-1,0 см, робили 1-2 обертальних рухів, після чого йоршик витягували. Досліджуваний матеріал вміщували в стерильні пластикові пробірки.
ПЛР проводили за допомогою комплексів "Амплі Сене", Росія для ампліфікації ділянок ДНК вірусу простого герпесу І та ІІ типів, мікоплазми й уреаплазми. Суть методу полягає у багаторазово повторюваних циклах синтезу специфічної ділянки ДНК-мішені в присутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидтрифосфатів, відповідного сольового буферу та олігонуклеозидних затравок - полімерів, які визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.
Кожний цикл складався з трьох стадій з різними температурними режимами. На першій стадії при температурі 94 ?С відбувалося розділення ланцюгів ДНК, на другій при температурі 50-65 ?С - приєднання (відпал) праймерів до гомологічних послідовностей на ДНК-мішені й на третій при температурі 72 ?С - синтез ланцюгів ДНК за допомогою подовження праймера в напрямку від 5'-кінця до 3'-кінця нитки ДНК. У кожному циклі здійснювалось подвоєння кількості копій ампліфікованої ділянки, що дозволило за 25-40 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою відібраних праймерів у кількості, достатньої для її детекції за допомогою електрофорезу.
Для діагностики супутньої інфекції відбирались системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяли ампліфікувати фрагмент, у якого для кожної системи праймерів наявна своя довжина.
Кількість лімфоцитів у крові визначали за уніфікованим методом В.В.Меньшикова, морфологічного дослідження форменних елементів крові з диференційованим підрахунком лейкоцитарної формули [96].
Дослідження Т-системи лімфоцитів проводили за допомогою реакції спонтанного розеткоутворення (Е-РУК) за J. Bach et al. (1969). Кількість Т-розеткоутворюючих клітин (Е-РУК) виражалась у процентах відносно усіх лімфоцитів. Оцінку проліферативної активності лімфоцитів здійснювали за методом Б.В. Пинегина и др. (2001), використовуючи для цього 5-, -6 карбоксифлуоресцеїндіацетат-сукцинілмедилефіру (КФДАСЕ). Суть вимірювання проліферативної активності лімфоцитів полягає в тому, що забарвлені карбоксифлюоресцеїном лімфоцити діляться під дією мітогену, із однієї клітини з більшою (вихідною) інтенсивністю свічення утворюються дві клітини, інтенсивність свічення кожної приблизно в два рази нижча вихідної і так далі. На цитометричній гістограмі забарвлені клітини розміщуються у вигляді ряду послідовних піків за спадаючою інтенсивністю свічення. За допомогою цитометричного методу можна простежити до 8 мітозів.
Для визначення функц