Розділ 2.
Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріали
Матеріалом для дослідження слугували зав`язі найбільш прогресивних в еволюційному плані однодольних та дводольних рослин: озима м'яка пшениця (Triticum aеstivum L.) сорту Безоста 1 та озима тверда пшениця (Triticum durum L.) сорту Парус, озиме жито (Secale cereale L.) сорту Харківське 60, крім того, зав'язі, які утворилися від схрещування твердої пшениці з м'якою (Triticum durum L. х Triticum aеstivum L.) і твердої пшениці з житом (Triticum durum L. х Secale cereale L.), а також соняшник (Helianthus annuus L.) сорту Одеський 128.
Сорт озимої м`якої пшениці Безоста 1 виведений методом індивідуального добору і відноситься до різновиду лютесценс (lutescens) лісостепової південної екологічної групи. Посухостійкість середня. Урожайність висока [125].
Сорт озимої твердої пшениці Парус виведений методом ступінчатої гібридизації сортів і форм м'якої пшениці з віддаленими еколого - геогра-фічними сортами ярової твердої пшениці. Зимостійкість середня [71].
Сорт озимого жита Харківське 60 виведений шляхом безперервного добору з гібрида. Відноситься до лісостепової екологічної групи. Сорт середньостиглий. Зимостійкість вища середньої. Посухостійкість хороша [136].
Сорт соняшника Одеський 128 - простий міжлінійний гібрид. Відноситься до середньоранньостиглої групи. Високотехнологічний. Добре вирівняний за висотою рослин та фенофазами розвитку [136].
Насіння для висівання на дослідній ділянці кафедри отримували в СГІ УААН.
2.2. Методи
Підготовку суцвіття до запилення, кастрацію та штучне запилення проводили за загальноприйнятою методикою [118].
2.2.1. Фіксація
Проведена темпоральна фіксація зав`язей до запилення та через різні проміжки часу після штучного запилення [103]. Так, зав'язі T. aеstivum L., T. durum L. та S. cereale L фіксували сумішшю Навашина та Чіаччіо на протязі доби через кожні дві години після запилення. Приймаючи до уваги неоднорідність і нерівномірність розвитку квіток у різних частинах колоса, у злаків запилювали і фіксували тільки нижні квітки колосків середньої частини головного колоса, коли пиляки були жовті. Контролем слугували зав'язі незапилених квіток одного і того ж колосу. Для T. aеstivum L., T. durum L. та S. cereale L було досліджено по 200 зав'язей із 60 різних рослин.
Зав'язі H. annuus L фіксували на протязі 8 годин сумішшю Карнуа через кожні 15 хв. після штучного запилення. Оскільки за великого об'єму досліджень доводилося фіксувати зав'язі з багатьох суцвіть, треба було мати впевненість про коректність зіставлення розмірів яйцеклітини і зиготи з різних суцвіть. У зв'язку з цим проводили додаткові дослідження з порівняння цитометричних показників яйцеклітини і зиготи в різних суцвіттях. Контролем у цьому випадку були зав'язі незапилених квіток того ж суцвіття, отже всі зав'язі були одного віку і знаходилися на однаковій відстані від центру. Як відомо, в суцвітті складноцвітих дозрівання квіток відбувається у радіальному напрямку, від периферії до центру кошика. Всього було досліджено 1000 зав'язей із 10 різних рослин.
2.2.2. Промивання та збезводнювання
Зафіксований за методом Навашина матеріал промивали у проточній воді, а за методом Карнуа - 70о спиртом. Для збезводнювання зав`язі проводили через серію спиртів, концентрація яких збільшувалась: 20о, 40о, 60о, 80о, 96о, абсолютний спирт [105, 124].
Збезводнені зав`язі проводили через суміші толуолу з абсолютним спиртом, через толуол та просочували парафіном за загальноприйнятою методикою [105].
2.2.3. Виготовлення парафінових блоків та отримання мікротомних зрізів
Для різки на мікротомі готували парафінові блоки методом закапування [103]. Зрізи товщиною 10-15 мкм отримували на санному мікротомі, наклеювали їх на предметні скельця розчином альбуміну, приготованого з білка курячого яйця.
Скельця зі зрізами залишали у термостаті при температурі 38о С на декілька діб для висушування, після чого депарафінували, поміщуючи в ксилол, ксилол видаляли шляхом заміщення його на 96 % спирт, останній видаляли промиваючи зрізи у воді.
2.2.4. Забарвлення зрізів
Препарати забарвлювали із застосуванням цитохімічних реакцій:
- на сумарні білки - з бромфеноловим синім за Мезіа [104];
- на нуклеїнові кислоти - за Фьольгеном, а також з метиловим зеленим - піроніном за Треваном і Шарроком [124];
- на ліпіди - з суданом чорним Б за Мак - Манусом; для контролю використовували органічні розчинники, які екстрагують ліпіди [56, 57].
- на полісахариди - ШИК - реакція за Шабадашем [124].
Крім того застосовували морфологічне забарвлення гематоксиліном за Гейденгайном [124].
Всього було виготовлено 1600 постійних препаратів.
2.2.5. Морфометрія
Поряд з цитохімічними проводили і цитометричні дослідження зародкового мішка. Препарати вивчали під світловим мікроскопом МБИ-3 при збільшенні окуляра 15х, об`єктива 8х та 40х. Фотографії зародкового мішка, яйцеклітини та зиготи робили за допомогою світлового мікроскопа Axioskop- ZEISS з фотокамерою CONTA при об. 100 х, ок. 10 х. Вимірювання діаметрів клітини, ядер та ядерець ( по 10-15 на кожний строк фіксування ) проводили за допомогою гвинтового окулярмікрометра МОВ - І - 15х при об`єктиві 40х.
Об`єм клітин, ядер та ядерець визначали в мкм3 за формулою:
де а - велика, в - маленька напіввісі (при еліпсоїдній формі), або
де r - радіус (при кулястій формі).
ЯЦС обчислювали за формулою:
де Vцитоплазми = V клітини - V ядра ;
ЯЯС обчислювали за формулою:
;
де Vсум. = Vядерця яйцеклітини + Vядерця спермію
2.2.6. Варіаційно - статистична обробка
Результати обробляли варіаційно-статистичними методами [108]. Спочатку знаходили середнє арифметичне ( М ) :
де ? V - сума об`ємів, n - кількість вимірювань.
Дисперсію вираховували за формулою:
,
де ? V2 - сума квадратів, а ( ?V )2 - квадрат суми.
Знаходили