ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Пространственные структуры протеазы ВИЧ-1.
Объектом расчетов МД служили пространственные структуры протеазы ВИЧ-1, определенные методом рентгеноструктурного анализа. Координаты атомов нативной протеазы ВИЧ-1 в полузакрытой конформации были взяты из файла 1ННР, а в закрытой конформации из файла 1G6L, которые находятся в Базе Данных Белков (PDB). Для создания мутантов использовалась структура 1G6L. На сегодняшний день имеется 5 пространственных структур аpо-формы нативной протеазы ВИЧ-1. Выбор структуры 1hhp обусловлен тем, что положение атомов было определено с точностью 2,0 A и является минимальным среди других структур аpо-форм данного белка. 1G6L является единственной структурой закрытой конформации несвязанного белка, определенной с точностью 1,9 A.
2.2. Программное обеспечение
2.2.1. Визуализация и графический анализ. Для визуализации рассчитанных траекторий МД использовали программу VMD и ngmx из пакета программ GROMACS [145]. Для визуализации согласованных движений протеазы ВИЧ-1 использовали модуль VMD - ied. Для визуализации отдельных конформаций, а также моделирования мутантов, использовалась программа SwissPDBViewer. Результаты ab initio расчетов визуализировались в программах Molden и Molekel.
2.2.2. Ковариационный анализ. Ковариационный анализ проводился с помощью программы g_covar и g_anaeig, из пакета программ GROMACS. Для расчета ковариационной матрицы использовались траектории С?-атомов протеазы ВИЧ-1: они являются достаточным набором атомов для представления движений белка. Для создания карт разниц использовалась программа MathLab.
2.2.3. Сравнение данных МД с данными ЯМР. Для сравнения данных полученных в ходе расчета МД с данными ЯМР была написана программа по расчету обобщенного параметра упорядочения, S2. Являясь мерой подвижности связи N-H из пептидной группы, S2 дает представление о гибкости остова по всей белковой молекуле, за исключением пролина (в силу отсутствия амидного водорода).
Исследование результатов расчета параметра упорядочения в зависимости от конформационной подвижности связи N-H привело к разработке улучшенного алгоритма расчета S2, что будет детально описано в главе 3 "Результаты исследования".
2.2.4. Построение КР-ДККМ. Карты разниц строили на основании данных программ g_covar и g_anaeig из пакета программ GROMACS. Сначала с помощью программы g_covar производили расчет ковариационной матрицы, собственных векторов и собственных значений, а затем отфильтровывали траекторию по первым четырем собственным векторам корреляционной матрицы. Данные заносились в Программу MathLab где был написан сценарий для построения ДККМ и затем КР-ДККМ с расчетом Ki.
2.3. Методика расчета молекулярной динамики и оптимизации геометрии
Расчет молекулярной динамики. Для расчета МД использовалась параллельная версия пакета программ GROMACS. GROMACS также был использован для анализа данных МД.
Общая схема расчета состояла в следующем (особенности систем для каждого расчета описаны в главе 3 "Результаты исследования"). Координаты кристаллической структуры протеазы ВИЧ-1 (далее структура) конвертировали из pdb формата во внутренний формат GROMACS - gro. При этом атомы водорода удалялись из pdb структуры и добавлялись заново в файл формата gro. Эту процедуру проводили для создания корректной топологии. Во всех расчетах использовалось силовое поле GROMOS43a1 [145]. Структуру помещали в бокс имеющий форму усеченного октаэдра с минимальным расстоянием от стенок бокса до атомов белка 10 A. Далее проводили минимизацию энергии системы в течение 200 шагов методом крутого спуска. Затем бокс заполняли SPC216 моделью воды [145]. Все молекулы воды, расстояние чьих атомов до атомов белка составляло меньше 3,4 A, были удалены. В расчетах, в которых необходимо было ввести ионы, использовали программу genion. Затем, опять, следовала минимизация энергии системы методом крутого спуска. Далее проводили расчет МД с гармонической привязкой атомов белка к их исходным координатам в течение 50 пс. Скорости атомов случайным образом генерировались согласно распределению Максвелла. Результирующую систему вводили как исходную в расчет МД. Интегрирование осуществлялось шагами по 2 фс с помощью метода попеременного опережения, эквивалентного алгоритму Верлета. Координаты атомов записывались в файл с периодичностью 1 пс. Длины связей поддерживались постоянными с помощью алгоритма SHAKE [145]. Электростатическое взаимодействие учитывалось по методу радиуса отсечки, PME или обобщенного реакционного поля [145]. Для ван-дер-ваальсового взаимодействия использовалась двойная отсечка: на расстоянии 0,9 нм взаимодействие учитывалось на каждом шаге, на расстоянии 1,4 нм - каждые 10 шагов. Температура системы и давление поддерживались постоянными по методу слабого соединения Берендсена [145].
Расчет аb initio. Вычисления на ab initio уровне аппроксимации проводились с помощью программы PC-GAMESS с использованием HF/6-31+G(d,p) базиса. Для построения модели активного центра использовались координаты остатков Leu24(только карбонильная группа)-Asp25-Thr26-Gly27 из обоих цепей (файл 1ННР). Литическая молекула воды была расположена согласно результатам работы [32]. При моделировании депротонированной протеазы ион натрия был помещен в те координаты, в которых находился атом кислорода литической молекулы воды.
2.4. Компьютерное оборудование
Вычисления проводились с использованием кластеров предоставленных фирмой Entry (www.Entry.kiev.ua), а также вычислительного центра Университета Гронигена, Нидерланды (hpc.rug.nl).
Кластер Entry имеет следующую конфигурацию: 4 двухпроцессорные ноды и гигабитная сеть. Нода состоит из 2 процессоров AMD 2000+ MP/DDR 512 Мбайт/HDD 40 Гбайт /Intel Gigabit Ethernet E1000.
Кластер Университета Гронингена стостоит из 128 однопроцессорных нод и сетью 10/10