РОЗДІЛ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ХВОРИХ І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика груп обстежених хворих
Дослідження морфологічних характеристик клітин та кількісних показників периферичної крові у дорослих хворих з різними хронічними лімфопроліферативними захворюваннями, що знаходились на обстеженні та проходили лікування, проводилось в гематологічних відділеннях №1 і №2 Київський клінічній лікарні №9 в період з 1998 по 2004 рр.
В відділі імуноцитохімії Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім.Р.Є.Кавецького нами проводився аналіз цитохімічних особливостей та імунофенотипу лімфоїдних клітин дорослих при різних формах лімфопроліферативних захворювань та інших формах гемобластозів. Дорослі, що були обстежені протягом 1998-2004 рр. , склали групу кількістю 173 особи (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Характеристика груп обстежених хворих на хронічні лімфопроліферативні захворювання
Нозологічна
формаВік хворих
(роки)Стать хворихЧоловікиЖінкиВ-ХЛЛ (n=60)
В-ПЛЛ (n=4)
ВКЛ (n=15)
Лімфоплазмо-цитарна лім-фома в стадії лейкемізації (n=19)
НЗЛ з клітин маргінальної зони в стадії лейкемізації (n=20)
НЗЛ з клітин фолікулярного центру в стадії лейкемізації (n=6)
НЗЛ з клітин мантійної зони в стадії лейке-мізації (n=14)
Т-ПЛЛ (n=3)
Синдром Сезарі/ грибовидний мікоз (n=4)
Лейкоз з ВГЛ (Т-та НK-клі-тинні варіанти) (n=28)39-80
52-69
35-64
29-73
28-80
36-65
33-74
38-82
63-80
18-8038
11
13
3
1522
6
14
13Всього хворих 17318-8210172
2.2. Методи дослідження
Дослідження периферичної крові хворих на пухлинні захворювання лімфоїдної тканини включали: 1. визначення показників гемоглобіну, еритроцитів, лейкоцитів та тромбоцитів за допомогою автоматичного геманалізатора; 2. морфологічну оцінку клітин крові в мазках, пофарбованих за Папенгеймом; 3. підрахунок лейкоцитарної формули.
Дослідження мазків кісткового мозку та периферичної крові на І етапі проводилось пофарбуванням за Папенгеймом, виконання комплексу цитохімічних реакцій для виявлення внутрішньоклітинної локалізації та активності ферментів (кислої фосфатази і кислої неспецифічної естерази, кислої фосфатази з інгібітором виннокислим калієм-натрієм (тартратом). Вміст глікогену визначали за допомогою PAS-реакції по Мак-Манусу і Хочкісу, кислої фосфатази методом азотосполучення по Гольдбергу та Барку, активність неспецифічної естерази в модифікації Лефлера. Методи цитохімічних досліджень детально викладені в монографії "Диагностика лейкозов. Атлас и практическое руководство". Київ, Наук. думка, 2000), авторами якої є співробітники відділу імуноцитохімії ІЕПОР ім.Р.Є.Кавецького НАН України. Діагностика різних форм хронічних лімфопроліферативних захворювань В-, Т- і НК-клітинного походження здійснювалась згідно з новою класифікацією ВООЗ (2001р.). У більшості хворих імунофенотипування проводили у цитологічних препаратах, виготовлених з відмитих клітин нативного кісткового мозку та венозної крові[20].
Процедура підготовки та проведення імуноцитохімічних досліджень включала: 1) виділення фракції мононуклеарів з венозної крові у градієнті щільності фікол-верографіну (1,076-1,080); 2) триразову відмивку виділених клітин ЗФР (рН 7,2-7,4); 3) приготування постійних цитологічних препаратів типу "висушеної краплі" з відмитих клітин; 4) фіксацію висушених при кімнатній температурі цитологічних препаратів в парах 10%-го нейтрального формаліну - 5 хв; 5) визначення експресії лінійно-специфічних, диференційованих і активаційних антигенів В-, Т-лімфоцитів, НК-клітин імуноцитохімічним лужнофосфатазним методом АВС-АР з використанням специфічних моноклональних антитіл до тих чи інших антигенів на І етапі та біотин-стрептавідинової системи на ІІ та ІІІ етапах відповідно (застосовували кролячі антитіла до Fab2-фрагментів імуноглобулінів миші, кон'юговані з біотином та стрептавідином, що мічений лужною фосфатазою). У випадках, коли матеріал від хворих (мазки периферичної крові та кісткового мозку) надходив у відділ імуноцитохімії з інших міст України, за умови короткочасного їх зберігання при +4?С (не більше 1-2 днів) та при достатній клітинності препаратів, імунофенотипування лімфоїдних клітин здійснювали безпосередньо в мазках. Для цього нативні мазки загортали у фольгу (по одному) та витримували щонайменше 1 годину у морозильній камері холодильника при температурі -20?С. Після розморожування і доведення до кімнатної температури для проведення імуноцитохімічної реакції мазки попередньо фіксували розчином забуференого формол-ацетону (pH 6,2-6,4) близько 1 хв з наступною відмивкою від фіксатора ЗФР. Процедура імунофенотипування включала такі основні етапи: 1) інкубацію з моноклональними антитілами відповідної специфічності протягом 1 години; 2) відмивку ЗФР - 1 хв; 3) інкубацію з міченими біотином антитілами до імуноглобулінів миші - 30хв; 4) відмивку у ЗФР -1 хв; 5) інкубацію зі стрептавідином, міченим лужною фосфатазою - 1 годину; 6) відмивку у ЗФР - 1 хв; 7) проведення цитохімічної реакції по визначенню активності лужної фосфатази з використанням в якості проявляючого реагенту нафтол-AS-MX-фосфату в трис-HCl-буфері (pH 8,7-9,2) та гексаазотованого парарозоніліну. Інкубація препаратів у такому розчині здійснювалась протягом 20 хв; 8) промивку препаратів дистильованою водою; 9) дофарбування ядер клітин специфічним барвником - 0,1% розчином метиленового зеленого протягом 1 хв. Результати імуноцитохімічної реакції оцінювали в імерсійній системі світлооптичного мікроскопу якісно та кількісно (оцінювали наявність чи відсутність, інтенсивність імуноцитохімічної реакції та підраховували процент клітин, що експресували певні антигени на поверхневих мембранах або в цитоплазмі). Кожного разу виконували відповідні контрольні дослідження[5].
Панель моноклональних антитіл, що використовувалась