РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
З метою вивчення росту та формоутворення кісток скелета в умовах опромінення та навантаження солями важких металів на фоні загальної гіпоксії проведено дослідження на 180 безпородних щурах-самцях 2- місячного віку масою 80-100 г, що перебували в стаціонарних умовах віварію. Ці тварини характеризуються однотипними реакціями на вплив різноманітних середовищних чинників та постійними ростовими процесами кісток скелета, що дає можливість простежувати особливості росту, будови та формоутворення кісткової системи на всіх етапах дослідження.
Перед початком експерименту тварин оглядали, враховуючи їх локомоторну активність та стан шкірного покриву. Під час дослідів у віварії підтримувалась постійна температура, тварини перебували в умовах належного догляду. Впродовж експерименту проводилися спостереження за динамікою маси тіла тварин кожні 10 днів.
Всі експерименти на тваринах проводилися з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).
Залежно від виду та режиму дії несприятливих чинників всі тварини були поділені на такі серії: контрольні та експериментальні.
Піддослідні тварини серед визначених серій були кількісно поділені на групи, виходячи з термінів отримання експериментального матеріалу: 1-ша група -1-ша доба; 2-га група - 7-ма доба; 3-тя група - 14-та доба; 4-та група - 21-ша доба; 5-та група - 28-ма доба.
Таблиця 2. 1
Розподіл експериментальних тварин
СеріяГрупа1(1 день)2(7 днів)3(14 днів)4 (21 день)5(28 днів)Іa- К6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів6 щурівІb- ГR + С6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів6 щурівІІ- Г6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів6 щурівIII-Г+R+С6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів6 щурівIV- Кор.6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів6 щурів
Іa серія (30 щурів) - контрольна - інтактні тварини, які поділені на п'ять груп за терміном спостереження експериментальних тварин (1,7,14,21,28 діб) по шість у кожній.
Іb серія (30 щурів) - контрольна - моделювання несприятливих екологічних умов Сумської області: загальне опромінення на установці "Rocus" (енергія квантів - 1,25 МеВ, потужність дози - 60 Р/хв.) протягом місяця в сумарній дозі 0,2 Гр. Тварини одночасно отримувала з питною водою солі цинку (ZnSO4 x 7H2O) - 5мг/л, хрому (K2Cr2O7) - 0,1мг/л і свинцю (Pb(CH3COO)2) - 0,1мг/л. Ці дози визначаються у воді та ґрунті Шосткинського району Сумської області (згідно "Доповіді про стан навколишнього природного середовища в Сумській області у 2000 році", виданої Міністерством екології та природних ресурсів України, Державним управлінням екології та природних ресурсів у Сумській області, яка є складовою частиною "Національної доповіді про стан навколишнього природного середовища в Україні у 2000 р.") [22].
ІІ серія (30 щурів) - моделювання загальної гіпоксії проводилося шляхом викликання стійких ішемічних порушень у серцевій тканині, за допомогою внутрішньом?язового введення диклофенаку натрію у дозі 0,012 мг/кг на вагу тіла, а через 15 хвилин розчину адреналіну у дозі 0,5-0,65 мг/кг, що сприяло розвитку загальногіпоксичних змін в організмі піддослідних щурів. Через 4 доби ін'єкцію повторювали. Наявність ішемії контролювалася за допомогою гістологічного дослідження шматочків міокарда.
ІII серія (30 щурів) - тварини перебували в умовах одночасної негативної дії загальної гіпоксії, опромінення та солей важких металів, за параметрами дії цих чинників для тварин ІІ і ІІІ серій.
IV серія (30 щурів) - проводилася корекція морфофункціональних змін у кістковій системі препаратом "Кальцій-Д3", який вводили перорально один раз на добу протягом всього експерименту. Препарат виробляється комапнією "Нікомед Фарма АС", серія: 10244317, реєстраційне посвідчення: Р.10.00/02296.
Даний препарат містить кальцію карбонату в дозі 1230 мг та вітамін Д3 у дозі 200 МЕ. Дана комбінація дозволяє більш інтенсивно засвоювати кальцій та депонувати його в кістковій тканині. Препарат сприятливо впливає на анаболічні та катаболічні процеси в кістковій тканині. Тому "Кальций Д3 Никомед" ефективно використовується для лікування та профілактики первинного та вторинного остепорозу. Даних щодо корекції будови та функціонування кісток в умовах констант нашого експеримента в доступній літературі немає.
Групи піддослідних тварин виводилися з експериментів шляхом декапітації під ефірним наркозом через 1, 7, 14, 21 та 28 діб. На дослідження забиралися великогомілкові, тазові кістки та ІІ і ІІІ поперекові хребці.
У своїх дослідженнях використовували такі методики: остеометрію, гістологічне дослідження, морфометрію, хімічний аналіз, електронну мікроскопію, математичну обробку цифрових даних .
Остеометричний метод. Остеометрію проводили за допомогою штангенциркуля з точністю до 0,01 мм. Остеометрія для великогомілкової кістки передбачала такі показники: найбільша довжина кістки, найбільша ширина проксимального та дистального епіфізів, найбільша ширина та передньозадній розмір середини діафіза; для тазової кістки та ІІІ поперекового хребця вимірювали найбільшу довжину, ширину та товщину кісток.
Гістологічний метод. Гістологічне дослідження діафіза та проксимального наросткового хряща великогомілкових кісток і ділянок тазової кістки та ІІІ поперекового хребця передбачало вивчення компактної та губчастої речовин і хрящової тканини. Для цього шматочки кісток фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, проводили декальцинацію в 10% розчині азотної кислоти, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації та заливали в парафін. Готували гістологічні зрізи товщиною 8-10 мкм та забарвлювали їх гематоксилін-еозином і за Ван-Гізоном.
Морфометричний метод. Морфометрія діафіза проводилася на персональному комп'ютері з використанням пакета програм "Видео Тест 5,0" та "Видео Размер 5,0" за такими параметрами: ш