РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження
Для вирішення поставлених в роботі завдань проведено клініко-статистичний аналіз перебігу вагітності, родів, стану плода та новонародженого у 700 вагітних з залізодефіцитною анемією (ЗДА) за даними акушерських клінік Інституту педіатрії, акушерства та гінекології АМН України (1998-2002 рр.). Комплексно в динаміці вагітності (І-а та ІІ-а половини) обстежено 172 жінки, із них 122 з ЗДА (основна група) та 50 соматично здорових жінок з фізіологічним перебігом вагітності, що склали контрольну групу. При комплексному обстеженні вагітних старанно вивчався соматичний, акушерський та гінекологічний анамнези, проводилось клініко-лабораторне та інструментальне дослідження.
Діагноз залізодефіцитної анемії встановлено за показниками вмісту гемоглобіну, кількості еритроцитів, кольорового показника, гематокриту, середнього об'єму еритроцитів, процента насиченості еритроцита гемоглобіном та його концентрації в еритроциті, коефіцієнту розподілу еритроцитів за об'ємом, рівня сироваткового заліза, вмісту феритину та трансферину, концентрації карбоксигемоглобіну. Кількісні показники гемограми визначались за допомогою гемоаналізатора НЕ-7000 та підраховувались в мазках периферичної крові, забарвлених за Романовським-Гімзою (оцінювались морфологічні характеристики еритроцитів). Залізозв'язуючу властивість білків сироватки крові (трансферину, феритину) визначали радіоімунним методом з використанням комерційних наборів Delfia та аналізатора Arcus (Фінляндія), концентрацію сироваткового заліза -фотометричним методом за допомогою системи "Лахема" діагностика (Чехія) та рівень карбоксигемоглобуліну - фотометричним методом.
Оцінка імунного статусу вагітних включала визначення кількості Т-лімфоцитів (СД3), Т-хелперів (СД4), Т-супресорів (СД8), В-клітин (СД19), активності натуральних кілерних клітин (СД16) та маркеру апоптозу (СД95), а також рівня цитокінів - інтерлейкіну (IL-2) і фактору некрозу пухлин - альфа (ФНП-?). Визначення кількості лімфоцитів та їх субпопуляцій в периферичній крові проводилось методом двокольорової проточної флюориметрії за допомогою наборів моноклональних антитіл фірми "Сорбент" (Москва). Визначення показників гуморальної ланки імунітету - рівня сироваткових імуноглобулінів (G, A, M) - проводилось за допомогою методу простої радіальної імунодифузії за E.Manchini (1965). Оцінку фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів здійснювали за методом проточної цитофлуориметрії. Як об'єкт фагоцитозу використовували штам Wood 46 Staphylococcus aureus. Бактерії вбивали прогріванням при температурі 60 °С на протязі 90 хвилин, відмивали і мітили шляхом додавання до суміші бактерій FITC (Calbiochem) США в забуференому фосфатами фізіологічному розчині (ЗФР) в кінцевій концентрації 2 мг/мл. Після інкубації на протязі чотирьох годин при кімнатній температурі і постійному помішуванні бактерії відмивали ЗФР з 0,1 % желатиною від незв'язаного FITC до його повного знебарвлення (контроль на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 495 нм). Концентрацію Staphylococcus aureus, помічених FITC, доводили 1x10 в Імл ЗФР і заморожували при - 20° С. 0,1 мл приготованої суміші змішували з 0,1 мл незмішаної гепаринізованої крові і інкубували 30 хвилин при 37° С. Фагоцитоз зупиняли шляхом додавання до крові 2 мл 3 мм ЕДТА і інкубували 30 хвилин при 4° С. Після центрифугування крові при 400 G 10 хвилин еритроцити лізували. Для лізісу еритроцитів використовували FACS Lising Solution "Becton Dicinson", США, деіонізовану воду і лізуючий реагент. Після дворазового промивання пробу ресуспензували в 0,5 мл ЗФР і аналізували на проточному цитофлуориметрі "FACScan". Нейтрофільні гранулоцити виділяли у відповідності з особливостями їх прямого і бокового світлорозсіювання. Реєстрували процент флуоресцуючих нейтрофільних гранулоцитів і середню інтенсивність флуоресценції. Вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) різної щільності - спектрофотометрично після осаду їх з сироваток поліетиленгліколем (Е.С.Белозеров, Т.А.Макарова, 1982; Г.В.Стручков та співавт., 1985). Концентрацію цитокінів IL-2 і ФНП-? визначали імуноферментним методом з використанням тест системи "IMMUNOTECH - Франція. Дослідження проводились за методиками виробника.
Матеріалом для бактеріологічного дослідження були виділення з піхви, цервікального каналу, уретри, носо-глотки. Бактеріологічні дослідження різних мікробіотипів вагітних жінок проводили якісним і кількісним методом з приміненням набору елективних діференціально-дігностичних поживних середовищ. Кількісним методом визначали лактобацили, стафілококи, стрептококи, ентеробактерії, гриби роду Candida. У всіх висіяних культур вивчали морфологічні, тинкторіальні, культуральні та біологічні властивості.
Кількість всіх видів бактерій в 1 мл виділень визначали за числом колоній, що виросли з урахуванням ступеня розведення посівного матеріалу. Показники 104-105 КОЕ/мл оцінювали як середній ступінь мікробного обсіменіння родових шляхів; при 106 і більше - як високий ступінь.
Для оцінки функціонального стану фетоплацентарного комплексу проведено дослідження вмісту прогестерону (П), естрадіолу (Е2), естріолу (Е3) та плацентарного лактогену (ПЛ) радіоімунологічним методом за допомогою стандартних тест систем "ХОП-ІБОХ-АНБ" (Білорусь). Вміст естріолу в сечі досліджували за методом I.Ittrich в модифікації С.Д.Булієнко та співавт. (1973). Аналіз кольпоцитограм за методом Шорра. Для кількісної оцінки кольпоцитологічних даних обчислювали індекси дозрівання (ІД), каріопікнозу (ІК) та еозинофілії (ІЕ). Визначення типів піхвових мазків здійснювали за загальноприйнятими класифікаціями кольпоцитограм для вагітних.
Для оцінки стану та характеру серцевої діяльності плода проводили кардіотокографічне (КТГ) дослідження з використанням нестресового тесту на біомоніторі "ВМТ 9141" фірми RTF. При розшифровці запису визначали такі параметри КТГ, які дозволяють достовірно оцінити стан серцево-судинної системи плода: базальна частота се