РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе была использована экспериментальная модель контаминации донорской
плазмы крови человека вирусным инфекционным материалом с подбором условий и
методов их инактивации с помощью фотосенсибилизатора фенотиазинового ряда МС и
дозированного УФО.
Основные методы и объём проведённых в диссертационной работе исследований
представлены в табл. 2.1.
Плазма.
Для исследований были использованы образцы свежезамороженной
карантинизированной в течение 6 мес. донорской плазмы (СЗП), полученной из
Киевского городского Центра крови. Плазма, согласно «Закону України про
донорство крові та її компонентів» № 239/95-ВР от 23.06.1995, была
предварительно протестирована с помощью тест-систем фирмы «DiaProphMed”
(Украина) на антитела к ВИЧ 1 и 2 типов, вирусному гепатиту С (анти-HCV),
HВsAg, сифилис и не содержала вышеперечисленные агенты.
Культура клеток.
Для культивирования модельных вирусов (вирусов полиомиелита и везикулярного
стоматита) использовали перевиваемую (пассажную) культуру клеток Нер 2 –
культура клеток карциномы гортани, полученная из вирусологической лаборатории
Центральной СЭС г. Киева [167-170].
Маточные культуры клеток Нер 2 выращивали в 1,0-1,5 литровых матрасах
Повитской, используя в качестве среды роста смесь сред 199 и ДМЕМ (среда Игла с
двойной концентрацией набора аминокислот и витаминов) в соотношении 1:1
(производство фирмы «Фармбіотек», Украина), эмбриональную телячью сыворотку в
количестве 10 % от объёма среды роста (производство фирмы «Perbio Sciense»,
Бельгия).
Таблица 2.1
Методы и объём проведённых исследований
Название метода
Спектрально-люминесцентные
Вирусологические
Электро-форез в ПААГ
Цитоге-нетичес-кие (ана-телофаз-ный метод)
Методы удаления МС
опреде-ление спектров поглоще-ния
опреде-ление спектров флуорес-ценции и возбуж-дения флуорес-ценции
титрова-ние методом бляшко-образо-вания
титрова-ние по цитопа-тическому эффекту
ультра-филь-трация
хромато-
графия
на
TSK-
геле
Количе-ство
опытов
1362
544
692
7872
56
2800
16
12
Итого
1906
8564
56
2800
28
Для предупреждения бактериальной контаминации сред были использованы
антибиотики: натриевая соль пенициллина и стрептомицин (производство завода
“Киевмедпрепарат”, Украина) из расчёта 150 ЕД и 100 ЕД соответственно на 1 мл
среды [167, 169-171].
Вирусы.
В качестве модельных использовались вирусы полиомиелита (ВП) и везикулярного
стоматита (ВВС), согласно принятой методике [167]. Используемые вирусы
отличались морфологией, типом симметрии и своими биологическими свойствами.
Вирусы везикулярного стоматита - относятся к сложным РНК-содержащим вирусам
семейства Рабдовирусов (Rabdoviridae), род - Vesiculovirus. Размер вирионов –
70-175 нм. В настоящее время известно 3 вида ВВС: Индиана (Indiana), Нью Джерси
(New Jersi) и Кокал (Cocal). Это возбудители псевдоящура, пустулёзного
стоматита лошадей и рогатого скота [172, 173].
В работе мы использовали штамм Indiana. ВВС - это вирусы, имеющие пулевидную
форму: один конец конический, другой срезан под прямым углом; покрыты двойной
липидной мембраноподобной надкапсидной оболочкой. Наружная, рыхлая, оболочка по
химическому составу представляет собой липопротеид, непосредственно к
нуклеотиду примыкает плотная белковая оболочка. Нуклеотид представлен
спиральнозакрученной одноцепочечной линейной фрагментированной РНК с
молекулярной массой 3,8 МД. Эти вирусы разрушаются эфиром и дезоксихолатом
натрия, при температуре 56 оС погибают через 20 мин, при 37 оС сохраняются в
течение 72 ч, при 18-20 оС – до 3,5 месяцев. Полностью разрушаются при рН 3,0;
оптимальная зона рН – 6,0-8,0. ВВС хорошо размножаются во многих видах тканевых
культур с цитопатическим эффектом [167, 172, 173].
Использование ВВС в качестве модельных обусловлено тем, что они по своим
свойствам приближаются к возбудителям, передающимся гемотрансмиссивным путём, и
являются сложными (оболочечными) вирусами.
В качестве модельных также были использованы вирусы полиомиелита (второго типа
Сэбина, штамм Р-712, Ch, 2 ab). Они относятся к семейству Пикорнавирусов
(Picornaviridae), роду энтеровирусов (Enterovirus). Вирусы полиомиелита состоят
только из РНК и белка (нет липидной оболочки), поэтому относятся к
безоболочечным (простым) вирусам. Вирусы имеют форму икосаэдра, размер вирионов
28-30 нм, молекулярная масса 8-9 МД. Нуклеотид представлен однонитчатой
нефрагментированной РНК с молекулярной массой 2,5 МД [168, 172, 173].
Ввиду отсутствия липидной оболочки, вирусы полиомиелита не чувствительны к
действию эфира и дезоксихолата натрия. При температуре 50 оС вирусы разрушаются
в течение 30 мин, полупериод жизни вирусов при 37 оС равен 48 ч. При
температуре 20-24 оС полная инактивация наступает к концу 3-го месяца,
замораживание при минус 20 оС или минус 70 оС сохраняет вирусы в течение года.
Эти вирусы устойчивы к действию рН в широких пределах (от 2,0 до 10,0), но
чувствительны к действию УФО и фотодинамическому действию нейтрального
красного, МС и толуидинового синего. В водной среде воздействие этих агентов
быстро инактивирует вирусы полиомиелита, лишённые примесных клеточных белков. В
богатой белками среде (например, в плазме) вирусы более устойчивы к действию
разных факторов [167, 172, 173].
В естественных условиях вирусы полиомиелита поражают человека и
человекообразных обезьян. Хорошо размножаются на первичных и перевиваемых
культурах из тканей человека и обезьян.
Учитывая вышесказанное, ВП были взяты в качестве модельных вследствие их
высок
- Київ+380960830922