РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріали
К л і н і ч н и й м а т е р і а л.
Матеріалом для вірусологічного дослідження були кров, слина і сеча вагітних
жінок віком від 18 до 38 років з різним терміном вагітності, в т.ч. вагітних з
обтяженим акушерським анамнезом (ОАА). Для контролю були обстежені жінки
репродуктивного віку (в т.ч. з ОАА, що було встановлено в результаті
ретроспективного аналізу історії хвороби) .
Крім того, матеріалом для дослідження були кров та тканини органів плодів, які
антенатально загинули (головного мозку, легень, печінці, нирок), а також
плацента жінок-породіль. Дослідний матеріал був отриманий із пологового будинку
№ 5, а також з акушерського відділення обласної клінічної лікарні м. Харкова.
Контингент та загальна кількість обстежених на антиген ВПГ 1/2 протягом
1999-2004 рр. наведені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Контингент та загальна кількість обстежених на ВПГ-інфекцію
Контингент обстежених
Кількість обстежених
В тому числі:
з ОАА
без ОАА
Вагітні жінки
256
147
109
Жінки репродуктивного віку
(контрольна група)
141
68
73
Всього
397
215
182
Одночасно були проведені дослідження по виявленню низькоавідних антитіл класу
Ig G у вагітних жінок з ОАА (117 осіб) та без ОАА (47 осіб), в крові яких був
виявлений ВПГ 1/2 - антиген.
52 вагітні жінки з асимптоматичною МПІ (32 з ОАА та 20 без ОАА) лабораторно
підтвердженіою ВПГ-інфекцєю за допомогою ІФА були обстежені на ДНК-ВПГ за
допомогою ПЛР.
Поряд з виявленням маркерів ВПГ-інфекції проведено виявлення цитомегаловірусних
клітин (ЦМК) в слині і сечі 108 вагітних жінок з МПІ і 37 вагітних жінок без
МПІ (контрольна група) на ЦМВ-інфекцію.
Загальна кількість органів від антенатально загиблих плодів та крові із
пуповини, а також плаценти жінок-породіль наведена в таблиці 2.2.
Таблиця 2.2
Загальна кількість зразків органів та крові плодів, плаценти жінок-породіль
Кров та органи плодів, які антенатально загинули
Кількість досліджених зразків
Плацента породіль
кров
органи плодів
Кров плодів із пуповини
Головний мозок
10
Легені
11
Печінка
12
Нирки
11
Всього
44
В і р у с.
Для проведення досліджень було використано вірус простого герпесу (ВПГ-1) штам
«УС» з інфекційною активністю 105 ТЦД50/мл. Вірус виділено у 1975 р. від
хворого з ГВІ, отриманий з колекції вірусів Інституту вірусології ім. Д.І.
Івановського РАМН (Москва, Росія). Штам використовується як вакцинний. Вірус
був люб'язно наданий к.б.н. Кривохатською Л.Д. (Інститут отоларингології ім.
О.С. Коломійченко АМН України). Вірус має паспорт.
2.1.3. К у л ь т у р а к л і т и н.
Для вірусологічних досліджень використовували перещеплювану культуру коронарних
судин теляти (КСТ). Культура адаптована до культивування на середовищі Ігла та
199 і у рівних об’ємах з 10 % сироваткою крові великої рогатої худоби при t 0
=37 0С, pH =7,2-7,4. Посівна доза - 80-125 тис. клітин в 1 см3. Тип росту –
епітеліоподібний. Культура складається із клітин, які варіюють за розмірами, з
округлими ядрами, що мають від одного до декількох ядерець різноманітної
форми.
2.1.4. С е р е д о в и щ а, т е с т-с и с т е м и т а р е а к т и в и.
Для виявлення антигену та визначення специфічних ВПГ антитіл використовували
тест-системи:
Тест-система імуноферментна для виявлення антигену вірусу простого герпесу 1 та
2 типів “Герпес Скрин” ЗАТ "НИАРМЕДИК ПЛЮС" (Росія).
Тест-система імуноферментна для виявлення антигену вірусу простого герпесу ЗАТ
БТК "БИОСЕРВИС" (Москва, Росія).
Тест-система імуноферментна для виявлення низькоавідних антитіл Ig G до
вірусу простого герпесу “Герпес-Диагност” ЗАТ БТК "БИОСЕРВИС"
(Москва, Росія).
Для генетичних досліджень використовували:
1. Комплект “ДНК-сорб-В” для виділення ДНК (“АмпліСенс”, Росія).
2. Комплект “АмпліСенс-200 HSV-430” для ампліфікації ділянки ДНК 430
п.н. gB-гену вірусу простого герпесу 1 та 2 типів (“АмпліСенс”, Росія).
Для культивування клітин та фарбування фіксованих препаратів:
Середовище 199, Ігла (DMEM), сольовий розчин Хенкса.
Сироватка крові великої рогатої худоби та ембріональна теляча сироватка.
Антибіотики (бензилпеніцилін натрієва сіль, стрептоміцин сульфат).
Розчини версену – 0,02 %, трипсину – 0,25 % .
Розчини спирту-ксилолу 3:1, 1:3 та чистий ксилол.
Гематоксилін.
Спирти 70°, 96° , абсолютний спирт.
Крім того, користувались різноманітним посудом для культур клітин:
пеніциліновими флаконами, “матрасами”, 96-лунковми стерильними планшетами,
центрифужними пробірками ємкістю 50 мл.
Для цитологічних та гістологічних досліджень:
Розчин азур-еозину по Романовському (ВАТ “Шосткінський завод хімічних
реактивів”).
Формальдегід.
Глутаровий альдегід (Німеччина).
Гематоксилін, еозин.
2.1.5. О б л а д н а н н я.
Імуноферментні дослідження проводили згідно інструкцій до тест-систем. Облік
здійснювали за допомогою імуноферментний аналізатора АІФ-Ц-01С (Білорусь).
Для роботи з культурами клітин використовували наступне основне обладнання:
Термостат.
Лабораторна центрифуга (1500, 3000 об./хв.).
Холодильники на +4 0С, - 20 0С.
4. Мікроскоп “OLYMPUS BH-2” з імерсійною системою.
Для гістологічних досліджень використовували наступне обладнання:
Електронний трансмісійний мікроскоп (ЕМБ-100 БР).
рH-метр.
Мікротом УМПТ–3М.
Мікроскоп ЛОМО (х300;х600; х1350; х2000 ).
Для одержання нуклеїнових кислот було використано обладнання наступного
порядку:
1. Ампліфікатор “ Терцик“ ( “ДНК-технология”, Росія).
2. Настільна мікроцентрифуга пробірок типу “Eppendorf” .
3. Вортекс (Биоком, Росія).
4. Термостат (25-100 0С) для пробірок типу “Eppendorf” (Росія).
5. Холодильники на +4 0С