Ви є тут

Морфофункціональні особливості міокарда теличок за різної рухової активності

Автор: 
Войналович Андрій Сергійович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U002036
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Клиническая характеристика больных
Материалами исследования были результаты комплексного обследования 135 женщин, из которых 102 больных РШМ 0-III стадии находились на стационарном лечении в гинекологическом отделении Харьковского областного клинического онкодиспансера (ХОКОД), 8 больных на амбулаторном лечении в поликлиническом отделении ХОКОД с 1999 по 2004гг.; 25 практически здоровых женщин составляли контрольную группу, обследованных в поликлиническом отделении ХОКОД с 2001 по 2004 гг. Комплексные обследования больных включали как общеклинические, так и дополнительные методы исследования. Кроме того, при необходимости проводили ультразвуковое исследование органов малого таза. Методы исследования и количество обследованных женщин приведены в табл. 2.1.1.
Определение стадии РШМ проводили соответственно классификации TNM (1997) [96] и FIGO (1997) [92].
У всех обследованных женщин анализировали данные анамнеза, жалобы, особенности менструальной и репродуктивной функций. Результаты такого анализа будут представлены при характеристике клинического материала в разделе 3.
При обследовании пациенток указанных групп, кроме общеклинических и лабораторных методов исследования, применяли методы углубленного обследования: кольпоскопические, цитологические, гистологические методы, ПЦР для обнаружения ВПЧ 16 и 18 типов.
Кольпоскопию проводили с помощью кольпоскопа "Сканер" (модель МК-200, №032-036).
В табл. 2.1 представлены методы исследования и количество обследованных женщин.
Таблица 2.1
Методы исследования и количество обследованных женщин
Методы исследованияКоличество
женщинОбщеклинические методы исследования135Бимануальное исследование половых органов135Кольпоскопический метод исследования135Цитологический метод исследования мазков из экто- и эндоцервикса135Гистологический метод исследования биоптатов шейки матки и операционного материала110Молекулярно-биологический метод выявления ДНК высокоонкогенных типов ВПЧ (16, 18) - ПЦР
(полимеразная цепная реакция)135Иммуноферментный метод исследования ИФН-?135Иммуноферментный метод исследования ФНО-?135Метод определения апоптотических клеток в мазках из шейки матки, в т.ч. из опухоли135Статистический метод обработки цифровых данных135
Простую кольпоскопию проводили при стандартном увеличении шейки матки в 8-10 раз и расширенную кольпоскопию - с использованием 3% раствора уксусной кислоты и 2% раствора Люголя (тест Шиллера). Расширенная кольпоскопия давала возможность более детально охарактеризовать эпителиальный пласт и сосудистый рисунок шейки матки, определить степень выраженности и локализацию патологического процесса, выбрать участок для проведения биопсии из патологического очага.

2.2. Метод выявления ВПЧ 16 и 18 типов
Для выявления папилломавирусной инфекции женских половых органов проводили молекулярно-биологическое исследование. Оно включало проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ДНК высокоонкогенных типов ВПЧ (16, 18 типы). Биоматериалом для проведения ПЦР служил соскоб с влагалищной части шейки матки (опухоли) и цервикального канала. Забор материала производили с помощью одноразовых стерильных зондов, исследуемый материал переносили в пробирку с реагентом.
ПЦР проводили по стандартной схеме при помощи программируемого термоциклера Терцик-2 фирмы "ДНК-технология" (Россия) с использованием термофильной ДНК-полимеразы НПО "Силекс М" (Россия). Использовались следующие праймеры FAP59 (5'-TAACWGTIGGICAYCCWTATT) and FAP64 (5'-CCWATATCWVHCATITCICCATC). Суть методики: с помощью праймеров амплифицируют фрагмент региона L1 HPV 16 и 18 типов размером около 480 пн. Параметры амплификации: денатурация 94°С -10 сек, отжиг 50°С - 10 сек, элонгация 72°С - 10 сек. Всего проводилось 45 циклов.
Результаты ПЦР оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозе с последующим окрашиванием бромистым этидием (концентрация 1 мг/мл). В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК плазмиды, гидролизованную ферментом HpaII.
ПЦР для выявления ДНК ВПЧ 16 и 18 типов проводили в лаборатории "Вирола" Харьковской медицинской академии последипломного образования (ХМАПО), зав. лабораторией Кульшин В.Е.

2.3. Методы определения ИФН-? и ФНО-? в сыворотке крови
Забор материала для исследования двух цитокинов ИФН-? и ФНО-? у обследуемых женщин проводили в 8 часов утра натощак, материал (венозную кровь) центрифугировали, выделенную сыворотку крови помещали в пробирку (до начала исследования хранили в холодильнике при температуре -18?С). Для измерения концентрации ИФН-? и ФНО-? в сыворотке крови использовали твердофазный иммуноферментный метод. Для анализа использовали наборы реагентов ProCon производства ООО "Протеиновый контур" (С.-Петербург).
Принцип анализа состоял в следующем. В наборе ProCon IF2 plus для измерения уровня ИФН-? использовали твердофазный иммуноферментный метод с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Один тип соответствующих исследуемому цитокину моноклональных антител иммобилизован на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы ИФН-? находится в наборе в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом является конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое сродство к биотину. После инкубации и промывки в ячейки вносили конъюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали, промывали, вносили субстрат и измеряли активность связанной пероксидазы с использованием автоматического фотометра. В норме концентрация ИФН-? в сыворотке крови колеблется от 5 до 50 пкг/мл.
Исследование содержания ФНО-? в сыворотке крови проводили также твердофазным иммуноферментным методом с использованием набора реагентов ProCon TNF? производства ООО "Протеиновый контур" (С.-Петербург). Принцип анализа для определения ФНО-? не отличалс