Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объекты и методы исследования
Для выполнения работы использовали крыс-самцов линии Wistar трех возрастных
групп: молодые – 1-1,5 месяцев (100-120 г), половозрелые – 6-8 месяцев (180-220
г) и старые – 22-24 месяца (320-380 г). Все животные находились в стандартных
условиях вивария Одесского национального университета имени И. И. Мечникова.
Все манипуляции с животными проводили согласно с Европейской Конвенцией о
защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных научных целей
(Страсбург, 1986).
Взаимодействие витаминов, коферментные формы которых входят в состав
дегидрогеназ 2-оксокислот, с тиамином при его фиксации в тканях печени,
двенадцатиперстной кишки и митохондриях выполнены на двух возрастных группах:
молодых – 1-1,5 месяцев и старых – 22-24 месяца.
Животным вводили 35S-тиамин в дозе 1,5 мкмоль/кг и совместно с витаминами.
Соотношения в смеси витаминов в мкмоль/кг были такими: тиамин – 1,5; ФМН – 7,5;
пантотенат-Са – 37,5; ЛК – 22,5; НА – 60. Эксперимент проводили в динамике: 15,
30, 60, 120, 240 мин. и 24 часа. Подсчет в-радиоактивности меченного тиамина
проводили в импульсах за 100 секунд на газопроточной установке типа «Протока».
Методом дифференциального центрифугирования выделяли общую фракцию митохондрий
по Джонсону и Ларди [Jonson D., Lardy H., 1967] в модификации [Кравченко Н.А.,
1990].
Определение свободного и общего тиамина проводили флуориметрично по методу
Янсена в модификации Елисеевой Г.Д. [Островский Ю.М., 1979] и Розанова А.Я.
(1989).
Взаимодействие коферментов 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса на уровне
митохондрий и очищенного комплекса было исследовано на молодых, половозрелых и
старых крысах. Смесь коферментов добавляли in vitro в микромолярном
соотношении, характерном для дегидрогеназ 2-оксокислот: ТПФ – 0,015, НАД – 0,6,
КоА – 0,375, ЛК – 0,225, ФМН – 0,075.
Выделение и очистку 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса осуществляли
методом Roche J.E., Cate R.J. (1977).
Ферментативную активность определяли феррицианидным методом [Kiessling K.- H.,
Lunquist C.G., 1962; Карпов Л.М., 1994] и тестом Варбурга [Островский Ю.М.,
1979]. Соответственно упомянутым методам определяли активность полиферментного
комплекса в нмолях восстановленного феррицианида / мин·мг белка та нмолях НАДН
/ мин·мг белка.
Содержание белка в тканях определяли по методу Лоури [Lowry O. et al., 1951].
Для выполнения диссертационной работы было использовано всего 210
разновозрастных крыс-самцов линии Wistar.
Для подсчетов полученных результатов применяли методы статистического анализа с
использованием параметрических критериев оценки отличий между виборками.
Достоверно отличными считались результаты при Р ? 0,05.
2.1.1. Реактивы, используемые при выполнении экспериментальной работы
Основная часть использованных реактивов соответствовала высоким требованиям
чистоты (фирмы Serva, Reanal, Sigma, Amersham, Ferak), остальные – производства
“Реахим” с характеристикой ч.д.а., которые при необходимости дополнительно
очищались.
Все использованные реактивы в методиках по определению ферментативной
активности готовились на бидистиллированной воде, полученной в специальном
стеклянном (на шлифах) перегонном аппарате.
2.1.2. Получение тканевых гомогенатов и митохондрий из органов крыс
Животных декапитировали, немедленно извлекали исследуемые органы (печень,
двенадцатиперстную кишку) и помещали их в стоящие на льду стаканчики с
охлажденной 0,25 М сахарозой. Органы промывали, просушивали фильтровальной
бумагой от избытка сахарозы и отвешивали один грамм ткани. Навеску помещали в
стеклянный гомогенизатор (Potter-Elveheim) с тефлоновым пестиком и добавляли 9
мл охлажденной 0,25 М сахарозы. Гомогенизатор находился в резиновом мешочке со
льдом.
Ткани разрушали вращением пестика со скоростью 2000 об./мин при одновременном
движении стеклянного корпуса вверх и вниз в течение 60-70 сек.
Двенадцатиперстную кишку, предварительно измельчив ножницами, разрушали
вращением пестика 2-3 мин.
Такая обработка обеспечивает получение гомогената, почти не содержащего
неразрушенных клеток и поврежденных митохондрий.
Из гомогената получали митохондрии методом Джонсона и Ларди [178].
Во всех опытах определение белка проводили методом Лоури [197].
2.1.3. Выбор метода определения скорости окисления 2-оксоглутарата и его
обоснование
Исходя из основной задачи данной работы, посвященной изучению взаимодействия
коферментных 2-оксоглутаратдегидрогеназе витаминов в условиях их раздельного и
совместного парэнтерального введения, на динамику окисления 2-оксоглутарата в
тканях крыс и митохондриях, а также влиянию соответствующих коферментов на
самосборку и активность 2-ОГДК in vitro, нам предстояло избрать соответствующий
метод исследования активности ферментного комплекса.
При этом мы учитывали два обстоятельства, затрудняющие выбор метода:
необходимость наличия в инкубационной среде всех кофакторов этого окисления и
определение скорости окисления 2-оксоглутарата в 2?оксоглутаратдегидрогеназной
реакции, а также возможность дальнейшего окисления образовавшегося сукцинил-КоА
в цикле ди- и трикарбоновых кислот.
Используемые методы оценки активности дегидрогеназ 2-оксокислот разнообразны.
Существуют манометрические методы, основанные на измерении количества СО2,
образующегося при окислительном декарбоксилировании 2-оксокислот, или О2,
поглощаемого тканями при этом процессе. Помимо кислорода при окислении
2-оксоглутарата используются и другие акцепторы электронов в
спектрофотометрических измерениях: НАД, 2,6-дихлорфенолиндофенол, феррицианид
калия,
- Київ+380960830922