РОЗДІЛ 2
ПРОГРАМА, МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Програма досліджень
Для розуміння доцільності та послідовності проведених нами досліджень наводимо
програму, за якою здійснювали експерименти. Всі проведені експерименти були
спрямовані на розкриття мети дисертаційної роботи – встановлення можливості
формування поверхневих компонентів у вірусів Коксакі В та їх дисоціантів за
рахунок клітинних структур та з’ясування їх впливу на біологічні властивості
віріонів.
Дослідження розпочинали з отримання вірусів Коксакі В у культурах
перещеплюваних клітин, визначення їх титру та концентрування різними способами.
Одним із важливих етапів роботи стало отримання, в результаті селекції,
бентонітових варіантів вірусів Коксакі В із дотриманням усіх правил та вимог до
цього процесу. Для того, щоб з’ясувати можливість існування у вірусів Коксакі В
додаткових поверхневих компонентів використано комплекс сучасних методів
дослідження, які умовно поділено на дві групи:
I – прямі методи, вони включали порівняльне електронно-мікроскопічне вивчення
особливостей морфології вихідних популяцій вірусів Коксакі В та їх бентонітових
варіантів. Використання даних методів дослідження дало змогу детально дослідити
на електронограмах вірусні поверхні, визначити розміри віріонів, їх відношення
до контрастерів і, найголовніше - встановити можливість асоціації вірусів
Коксакі В з компонентами хазяйських клітин, зруйнованих під час репродукції
вірусів.
II- непрямі методи, останні передбачали визначення впливу органічних
розчинників на зміну біологічних властивостей вірусів Коксакі В (сорбційні
характеристики, ефективність нейтралізації типоспецифічними діагностичними
сироватками, виживання у лабораторних умовах та після дії таких екстремальних
для даних вірусів факторів, як ліофільне висушування). Непрямі методи також
включали порівняльне дослідження динаміки збереження інфекційності вірусів
Коксакі В та їх бентонітових дисоціантів в лабораторних умовах в залежності від
наявності у вірусовмісному матеріалі клітинного детриту. Ці методи дослідження
могли опосередковано підтвердити, або спростувати існування поверхневих
компонентів у досліджуваних ентеровірусів та, взагалі, дали змогу з’ясувати
значення клітинного оточення для ентеровірусних популяцій.
2.2. Матеріали
2. 2. 1. В і р у с и [212].
У проведених експериментах були використані прототипні штами вірусів Коксакі В,
одержані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів імені М.П. Чумакова
РАМН, а саме, Коксакі В-1 (штам Connecticut-5); Коксакі В-2 (штам Ohio-1);
Коксакі В-3 (штам Nancy); Коксакі В-4 (штам Powers); Коксакі В-5 (штам
Faulkner); Коксакі В-6 (штам Hammon).
У кожного з взятих для роботи штаму вірусів Коксакі В існує паспорт. Всі
зазначені вірусні штами зберігаються у музеї кафедри мікробіології, вірусології
та імунології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ
України.
2. 2. 2. К у л ь т у р и к л і т и н [135,136,137].
Для проведення експериментальних досліджень використано наступні перещеплювані
культури клітин:
НЕр-2 – клітини карциноми гортані людини;
НеLа - клітини карциноми шийки матки людини;
Vero – клітини нирки африканських зелених мавп.
Клітинні культури зберігались в кріомузеї кафедри мікробіології, вірусології та
імунології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ
України.
2. 2. 3. Е к с п е р и м е н т а л ь н і т в а р и н и [133].
Деякі серотипи вірусів Коксакі вирощували в організмі новонароджених білих
мишей-сисунців лінії BALB/c. Матеріалом для виділення вірусів Коксакі В
слугували їхні тушки, які суспендували в середовищі DМЕМ з антибіотиками.
Загальна кількість тварин становила 83 особи.
Утримання під час експерименту, мікроклімат, температура, вологість, світловий
режим, об’єм повітря, тип підстилки відповідали прийнятим в нашій державі
нормативам документам, які регламентують використання тварин для
експериментальних досліджень, а також вимогам Європейської конвенції по захисту
хребетних тварин, які використовуються з експериментальною метою.
2.3. Одержання гелю бентоніту
Приготування природного сорбенту - бентоніту для проведення вірусологічних
досліджень здійснювали за загальноприйнятою методикою, яка розроблена
академіком Широбоковим В.П. [7]. Вміст бентоніту в отриманому гелі визначали
шляхом його висушування в сухожаровій шафі при 105°С з подальшим зважуванням
сухого залишку. Як правило, використовували 5-6 % суспензію бентоніту.
Стерилізацію даного сорбенту здійснювали автоклавуванням протягом 40 хв при 0,5
атм.
2.4. Вірусологічні методи
2. 4. 1. К у л ь т и в у в а н н я к л і т и н [135,136,137].
Перещеплювані клітинні культури (Vero, HEp-2, HeLa) вирощували за
загальноприйнятою методикою. Середовища росту містили 7% ембріональної або 8-9%
сироватки новонароджених телят "Sigma".
2 .4. 2. О д е р ж а н н я в і р у с і в Коксакі В [138].
Використана нами методика отримання вірусів Коксакі В у культурах клітин
принципово не відрізнялась від загальновідомої Культивування клітин,
інфікованих вірусами Коксакі В, здійснювали при температурі + 37°С до розвитку
повної цитопатичної дії, як правило цей час складав 2-4 доби. Отриманий
вірусовмісний матеріал тричі заморожували та розморожували, центрифугували при
3500 об/хв., титрували та зберігали при температурі -20°С.
2. 4. 3. В и д і л е н н я в і р у с і в К о к с а к і В з о р г а н і з м у і
н ф і к о в а н и х м и ш е й – с и с у н ц і в.
При виділенні вірусів з мишей-сисунців, матеріалом слугував їх
м’язово-кістковий комплекс. Дослідження проводили таким чином: шматочки тканини
зважували
- Київ+380960830922