РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкти дослідження
Дослідження проведено в експерименті на 123 білих безпородних щурах-самцях:
статевонезрілих віком 1 місяць і масою 50-55 г; статевозрілих віком 8 місяців і
масою 280-310 г; „старих” віком 18 місяців і масою 330-350 г.
При виконанні досліджень нами були враховані біологічні ритми, добові та річні
зміни лімфоїдних органів, тому експерименти та забір матеріалу проводили в
осінньо-зимовий період, у другій половині дня з 13 до 14 години у фазу
функціонального спокою слизової оболонки шлунка [30] з урахуванням добових
ритмів функціональної активності шлунка [144].
Контрольні та піддослідні тварини перебували в окремих боксах у приміщенні
віварію Ужгородського національного університету та утримувалися в однакових
умовах з однотипним режимом під наглядом ветеринарного лікаря. Тварин годували
два рази на день за нормами (Наказ МОЗ СРСР №1179 від 10 жовтня 1983 р. – «Об
утверждении нормативов затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях
здравоохранения»).
Утримання, догляд за тваринами і всі маніпуляції проводили у відповідності з
положенням „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які
використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург,
1986), „ Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, ухвалених
Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001 р.) та вимог Додатку 4 до
„Правил проведення робіт з використанням експериментальних тварин”,
затверджених наказом Міністерства охорони здоров’я №755 від 12 серпня 1977 р.
«Про заходи щодо подальшого удосконалення організаційних форм роботи з
використанням експериментальних тварин». Комісією з питань біоетики медичного
факультету Ужгородського національного університету (протокол № 5 від 23
листопада 2005 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні
науково-дослідної роботи на експериментальних тваринах не виявлено.
Імуноморфологи та інші дослідники часто використовують в якості
експериментальної моделі білих щурів, внутрішні органи яких та органи імунної
системи за структурою принципово не відрізняються від будови органів людини
[126, 144, 235].
Об’єктом дослідження були шлунки білих безпородних щурів-самців різного віку.
Досліджено 3 групи тварин. Перша група – інтактні тварини: статевонезрілі (10),
статевозрілі (11) та «старі» (10) білі безпородні щури-самці. Друга група –
експериментальні тварини, яким вводили антиген – «Імуноглобулін людини
нормальний» в дозі 0,02 мг імуноглобуліна із розрахунку на 100 г маси тварин в
0,2 мл стандартного фізіологічного розчину. Третя група – контрольні тварини,
яким замість антигену вводили стандартний фізіологічний розчин в еквівалентних
до імуноглобуліна об’ємах. У кожній віковій групі і серії щурів було по 5
тварин.
Для дослідження забирали шматочки шлунків щурів розмірами 1,0 х 1,0 см з
передньої стінки дна шлунка біля великої кривини, кардіальної і воротарної
частин. Шматочки шлунків фіксували упродовж двох тижнів у 10 % розчині
нейтрального формаліну, після чого заливали в парафінові блоки.
Антигеном обрано «Імуноглобулін людини нормальний» виробництва «Біофарма» (м.
Київ), який має високі антигенні властивості з дуже незначною токсичною і
пірогенною діями і є універсальним стимулятором імунних процесів в організмі
[45]. Імуноглобулін вводили в дозі 0,02 мг імуноглобуліна із розрахунку на 100
г маси тварин в 0,2 мл стандартного фізіологічного розчину в асептичних умовах
під шкіру тила стопи правої задньої кінцівки щурів.
Контрольній групі тварин замість антигену вводили в ту же саму ділянку
стандартний фізіологічний розчин в еквівалентних до імуноглобуліна об’ємах аби
переконатися в тому, що сама процедура підшкірного введення антигену
експериментальним тваринам не викликає морфологічних змін у лімфоїдних
структурах слизової оболонки шлунка білих щурів.
Під ефірним наркозом проводили декапітацію щурів, розсікали шкіру і м’які
тканини живота, вскривали черевну порожнину і проводили забір шлунків
інтактних, контрольних та експериментальних тварин. Шлунки експериментальних
тварин забирали після введення антигену через 1, 3, 7, 14 діб і один місяць, а
також через 1 добу після введення тваринам замість антигену стандартного
фізіологічного розчину.
Такі строки забору матеріалу обрано нами згідно даних літератури [45, 52], у
які відзначаються найбільш помітні зміни морфофункціональних параметрів у
лімфоїдних органах після антигенної стимуляції організму.
2.2. Методи дослідження
Фіксація і заливка шматочків шлунка у парафінові блоки
Шматочки шлунків після фіксації у 10 % нейтральному формаліні заливали в
парафінові блоки:
– промивання після фіксації водопровідною водою – 12 годин;
– 70° етиловий спирт – 6 годин;
– 96° етиловий спирт І порція – 6 годин;
– 96° етиловий спирт ІІ порція – 6 годин;
– 100° етиловий спирт І порція – 6 годин;
– 100° етиловий спирт ІІ порція – 6 годин;
– суміш 100° спирту і хлороформу у співвідношенні 1:1 – 3 години;
– хлороформ: І порція – 1,5 години;
ІІ порція – 1,5 години;
– суміш хлороформу і парафіну у співвідношенні
1:1 („Каша”) в термостаті при t° +56°С – 2 години;
– розтоплений парафін в термостаті при t°+56°:
І порція – 1 година;
ІІ порція – 1 година;
– заливка об’єктів гарячим парафіном.
З парафінових блоків на санному мікротомі виготовляли гістологічні зрізи
товщиною 5-7 мкм. Площина зрізу проходила перпендикулярно до стінки шлунка.
Гістологічні зрізи фарбували гематоксилін-еозином і азур ІІ-еозином
загальноприйнятим способом.
Забарвлення гістологічних зрізів стінки
- Київ+380960830922