РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень.
У роботі використані хімічні сполуки, реактиви та ферменти виробництва фірм:
“Sigma” (США), “Ferak” (Німеччина), “Reanal” (Угорщина) “Fermentas” (Литва),
“NEB” (США), “Promega” (США), “Difco” (США). Кваліфікація хімічних реактивів
вітчизняного виробництва - “хч” та “осч”.
2.1.1. Штами мікроорганізмів. Штами дріжджів Candada famata, Debaryomyces
hansenii, Pichia guilliermondii та бактерій Escherichia coli, що
використовувались у даній роботі представлені у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Штами мікроорганізмів, використані в роботі
Назва штаму
Генотип
Посилання*
Дріжджі
P. guilliermondii:
RG21 (ATCC201910)
RG2
RG1
RG8
RG68
RG130
C. famata:
VKM Y-9
L20105
8-77
3-25
8-80
33-1n
6-33n
4-32n
6-29n
hisХrib1
hisХrib2
hisХrib3
hisХrib5
hisХrib6
hisХrib7
дикий штам
leu2
leu2 rib1
leu2 rib1
leu2 rib1
leu2 rib2
leu2 rib5
leu2 rib5
leu2 rib5
[79]
там же
там же
там же
там же
там же
[80]
Продовження Таблиці 2.1.
Назва штаму
Генотип
Посилання*
42-6n
6-10
5-133
8-15
8-33
8-70
4-126-31
3L2
101R
4R
1R
D. hansenii
CBS 767
Бактерії
E. coli
DH5б
ribA802-81
ribB802-45
leu2 rib5
leu2 rib6
leu2 rib6
leu2 rib6
leu2 rib7
leu2 rib7
leu2 rf(-Fe)
leu2::LEU2
rib1::LEU2
met2::LEU2
sef1::LEU2
дикий штам
lacZДM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rK-, mK+), supE44, relA1, deoR,
Д(lacZYA-argF)U169
hsdR+, hsdM+, gal-, met-, supE, ribA
hsdR+, hsdM+, gal-, met-, supE, ribВ
[81]
[82]
[82]
*Посилання подані для штамів, описаних іншими авторами.
2.1.2. Плазміди. Плазміди, що використовувались у даній роботі представлені у
таблиці 2.2.
2.1.3. Поживні середовища. Штами дріжджів вирощували при 28oС на багатому
середовищі (YPD: 1% дріжджовий екстракт, 1,5% пептон, 2% глюкоза [81]) та на
стандартному мінімальному середовищі (YNB: 0,67% Yeast Nitrogen Base, 2%
глюкоза) або мінеральному середовищі Беркгольдера наступного складу у г/л:
глюкоза 20 г; (NH4)2SO4, 3 г; KH2PO4, 0,5 г; MgSO4 Ч 7H20, 0,2 г; CaCl2 Ч 6H2O,
0,2 г; Na2HPO4, 0,1 г; біотин, 1 мкг; залізо у складі
Таблиця 2.2.
Рекомбінантні плазміди, використані в роботі
Назва
Посилання на конструювання
pCf14
pCR1 (Рис. 3.1.А.)
PRp1 (Рис. 3.1.Б.)
pCR1Xb (Рис. 3.1.В.)
pCR2 (Рис. 3.3.А.)
PRp2 (Рис. 3.3.Б.)
pCR2-1 (Рис. 3.3.В.)
pRIV-2 (Рис. 3.5.А.)
PRpIV-2 (Рис. 3.5.Б.)
р19Р (Рис. 3.5.В.)
pF (Рис. 3.6.)
p19R1
pPgARS19 (Рис. 3.8.А.)
pRР5 (Рис. 3.8.Б.)
pCR7 (Рис. 3.10.А.)
PRp7 (Рис. 3.10.Б.)
p19PR3
РР+ (Рис. 3.14.А.)
рТСК (Рис. 3.14.Б.)
pUC57
pL2 (Рис. 3.18.)
pTb (Рис. 3.22.A.)
pTCfRIB1 (Рис. 3.22.Б.)
pTDhMET2 (Рис. 3.22.В.)
pTDhSEF1 (Рис. 3.22.Г.)
[80]
Пункт 3.1.2. даної дисертації
Те саме
Те саме
Пункт 3.1.4. даної дисертації
Те саме
Те саме
Пункт 3.1.6. даної дисертації
Те саме
Те саме
Те саме
[83]
Пункт 3.1.8. даної дисертації
Те саме
Пункт 3.1.10. даної дисертації
Те саме
Пункт 3.1.12. даної дисертації
Пункт 3.2.2. даної дисертації
Пункт 3.2.5. даної дисертації
[84]
Пункт 3.2.6. даної дисертації
Пункт 3.2.8. даної дисертації
Те саме
Те саме
Те саме
солі Мора, 0,4 мг. Кінцева концентрація мікроелементів: 0,2 мкM CuSO4 Ч5H2O,
1,25 мкM KI, 4,5 мкM MnSO4 Ч H2O, 2,0 мкM NaMoO4 Ч 2H2O, 0,75 мкM H3BO3, 17,5
мкM ZnSO4 Ч 7H2O [85]). Використовували середовища з оптимальним для росту (0,2
мг/л “+Fe”) і низьким (0,01 мг/л “-Fe”) вмістом іонів заліза. Середовище
попередньо очищали від іонів металів за допомогою 8-гідроксихіноліну або при
додаванні ферозину в агаризоване середовище. або при додаванні 1мМ
3-(2-піридил)-5,6-дифеніл-1,2,4-триазин-4’,4’’-дисульфонової кислоти (ферозин)
в агаризоване середовище. Да “+Fe” або “-Fe” середовищ в якості джерела азоту
та вуглецю додавали сечовину (1 г/л) та сахарозу (20 г/л), відповідно. Для
характеристики РФ-залежних мутантів у культуральне середовище додавали діацетил
(800 мг/л). Ростові тести проводили на мінімальному середовищі з додаванням
діацетилу (100 мг/л) або ДМРЛ (200 мг/л) [79]. Амінокислоти додавались до
середовища в концентрації 40-50 мг/л, РФ - 200 мг/л. Агаризовані середовища
містили 2% агару.
Бактерійні штами вирощували при 37оС на багатому (LB) середовищі, [81]. Для
селекції плазмідовмісних бактерій використовували ампіцилін у концентрації 100
мг/л. РФ-залежні штами E. coli вирощувалися на середовищі, що містило РФ (50
мг/л).
2.2. Методи дослідження.
2.2.1. УФ-мутагенез. Отримання мутантних штамів дріжджів C. famata індукували
УФ-світлом (лампа БУВ-15). Доза опромінення, яку було використано при
мутагенезі забезпечувала 5-10% виживання клітин C. famata.
2.2.2. Трансформація сферопластів флавіногенних дріжджів P. guilliermondii та
C. famata [80]. Метод ґрунтується на здатності екзогенної ДНК проникати в
дріжджові клітини у яких частково, або повністю усунена за допомогою
специфічного фермента – в-1,3-глюкуронідази (препарати наявні у продажу мають
назви літиказа, або зимоліаза) клітинна стінка. Для флавіногенних дріжджів P.
guilliermondii і C. famata застосовували модифікований метод трансформації
сферопластів, описаний для P. pastoris [86,87].
Реактиви:
SED буфер: 1 М сахароза, 25 мМ ЕДТА (етилендиамінтетраацетат), 50 мМ ДТТ
(дитіотреітол);
SCE буфер: 1 М сахароза, 0,1 М цитрат натрію (pH 5,8), 10 мМ ЕДТА;
CaS буфер: 10 мМ CaCl2, 1 М сахароза;
SOS середовище: 1 М сахароза, 30% YPD, 10 мМ CaCl2;
ПЕГ (поліетиленгліколь): 40% ПЕГ 3000, 1 М Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 М CaCl2.
Хід роботи.
Свіжу колонію дріжджових клітин інокулюють в 3 мл рідкого багатого середовища
та вирощують в умовах аерації при 30оС протягом 20-22 год. Отриману культуру
клітин розводять в 200-1000