Вы здесь

Ідентифікація та характеристика білків-партнерів фосфатази PTEN

Автор: 
Горбенко Олена Миколаївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2006
Артикул:
0406U004805
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та обладнання
В роботі використовували: центрифуги “MSE Hight Speed 18”, “Backman L-5”,
“Eppendorff 5447R”, „Microspin 24S DuPont”, рН-метр “Hanna”, денситометр
"Anthos2001", прилад для напівсухого електропереносу “Trans Blot SD” фірми Bio
Rad та інші.
Використовували бензамідин, леупептин, апротинін – “Amеrsham”, США,
2-меркаптоетанол, деоксихолат натрію – “Merck”, ФРН; ФМСФ – “Calbiochem”,
Швейцарія; додецилсульфат натрію, персульфат амонію – “Bio-Rad”, США; трис -
“Sigma”, США, кумасі діамантовий голубий R-250 та G-250, акриламід, ЕДТА,
TEMEД, ДMСO, ДТТ – “Serva”, США; Твін 20, метиленбісакриламід, етидій бромід –
“Sigma”, США.
Використували також HCl, KOH, CH3COOH, KCl, NaCl, NaH2PO4, KH2PO4, СаСl2,
MgCl2, етанол, бромфеноловий синій, гліцин, амінооцтову кислоту вітчизняного
виробництва, кваліфікації о.с.ч.
Середовища для культивування еукаріотичних ліній клітин ссавців DMEM і RPMI
виробництва «Invitrogen» (США) і середовище для культивування клітин комах
ТС100 виробництва «United States Biological» (США); інсулін, IBMX
(3-ізобутил-1-метилксантин), дексаметазон виробництва “Sigma”, США.
2.2. Плазміди, штами та клітинні лінії
Плазміди, що використовували у скринуванні за допомогою дріжджової двогібридної
системи:
1. Всі репортерні плазміди мали ген URA3 для селекції трансформованих клітин
дріжджів на ura— селективному середовищі. Плазміда pSH18-34 містила 8
операторних послідовностей для білка LexA в промоторі репортерного гена LacZ. У
плазміді pJK101 ген LacZ знаходиться під контролем промотора GAL1, між ним і
послідовністю гена LacZ містяться 2 операторні послідовності для білка LexA;
2. Тестові/контрольні плазміди мали ген HIS3 для селекції трансформованих
клітин дріжджів на his— селективному середовищі. Плазміда pSH17-4 містила кДНК
домена транс-активації фактора транскрипції Gal4p, вбудовану в рамці з кДНК
послідовністю, яка кодує LexA; ця плазміда використовується як позитивний
контроль активації транскрипції. Плазміда pEG202-Max експресує LexA-злитий
білок Max і використовується як позитивний контроль експресії
«байт»-конструкції в дріжджах; pBait (з англ. «приманка») – системна
конструкція, що конститутивно експресує LexA-злитий білок, який специфічно
взаємодіє з білком іншої системної конструкції pTarget; pTarget (з англ.
«мішень») - експресує В42-злитий білок, який специфічно взаємодіє з LexA-злитим
білком, що експресується з pBait;
3. Вектори для створення «байт»- конструкцій містили як селективний маркер ген
HIS3 для селекції трансформованих клітин дріжджів на trp— селективному
середовищі: рEG202 (містить ДНК-послідовність, що кодує LexA, за якою іде
полілінкер для вбудовування кДНК-послідовності відповідного «байт»-білка),
рEG202-NLS (аналогічний рEG202, але містить послідовність сигналу ядерної
локалізації між LexA та полілінкером для вбудовування кДНК послідовності
відповідного «байт»-білка), pNLexA (LexA розташований не перед, а після
полілінкера).
Для двогібридного скринування використано три кДНК-бібліотеки - раку кишечнику
людини (7,98 х 106 індивідуальних клонів), 18-денного ембріона миші (1,0 х 107
індивідуальних клонів) та клітин HeLa (9,6 х 106 індивідуальних клонів).
Бібліотечні плазміди включали, як селективний маркер, ген TRP1 для селекції
трансформованих клітин дріжджів та кДНК послідовність, що кодує білок B42, яка
знаходиться під контролем індуцибельного GAL1-промотора; полілінкер для
вбудовування кДНК-вставок при створенні кДНК бібліотек розташовано після
кДНК-послідовності білка В42).
Плазміди для експресії рекомбінантних білків у клітинах E.coli – pET28а, рЕТ30а
(Novagen, США), pGEX4T1 (Amersham BioSciences, США).
Плазміда pFAST HTb для транспозиції вбудованої вставки в бакміду bMON14272
(Invitrogen, США).
Штами Saccharomyces cerevisiae, що використовували у скринуванні за допомогою
дріжджової двогібридної системи :
EGY48. Генотип: MAT alpha, his3, trp1, ura3, 6LexAo.p.-LEU2.
RFY206. Генотип: MATa, trp1, his3, ura3, leu2, lys2.
Штами Escherichia colі:
КС8. Генотип: hsdR, leuB600, trpC9830, pyrF::Tn5, hisB463, lacDX74, strA, galU,
K.
DH10Bac. Генотип: F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15 lacX74 deoR recA1
endA1 araD139 (ara, leu) 7697 galU galK- rpsL nupG /bMON14272 / pMON7124.
BL21(DE3)pLysЕ. Генотип: F" ompT hsdSs (rb- mb-) gal dsm (DE3) pLysS (CamR).
Штам DE3 містить DE3 лізоген, під контролем РНК полімерази T7 промотора lacUV5.
ІПТГ є необхідним для індукування експресії T7 РНК полімерази.
Еукаріотні лінії клітин: HEK293 (клітини ембріональної нирки людини), NIH3T3
(клітини фібробластів миші), NIH3T3L1 (клітини преадпипоцитів миші), Sf9
(клітини комах).
2.3. Метод двогібридного дріжджового скринування
В даній роботі було використано модифікацію двогібридної дріжджової системи
DupLEX-ATM, розроблену OriGene Technologies, Inc. (США).
2.3.1. Створення «байт»-конструкцій. Для створення «байт»- конструкцій було
використано послідовності кДНК, що кодують повнорозмірну молекулу фосфатази
PTEN дикого типу, мутантні форми PTEN з амінокислотними замінами C124S та G129E
з повною та частковою втратою фосфатазної активності, відповідно, та С-кінцевий
фрагмент фосфатази. Послідовності ампліфікували за допомогою ПЛР з
використанням відповідних олігонуклеотидів. Продукти реакції ампліфікації
розділяли в агарозному гелі, елюювали з гелю і вбудовували в вектори pEG202 і
pEG202-NLS по сайтах розпізнавання рестриктазами EcoRI та BamHI. Наявність
вставки було перевірено рестрикційним аналізом. Співпадіння рамки зчитування
«байт»-білка з послідовністю LexA було під