РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
2.1. Загальна характеристика експериментальної моделі і тварин.
З метою виявлення ролі тимусу в формуванні кісткової тканини було використано модель тимектомії. Вказана модель була вибрана по декільком причинам. По-перше, як було вказано вище, добре відомо про вплив зрілих Т-клітин в дорослому організмі на процес ремоделювання кістки, який опосередкований продукцією цитокінів [8, 96, 113, 119, 165]. По-друге, фактори, що специфічно впливають на розвиток і диференцировку остеокластів, а саме, рецептор, активуючий ядерний фактор NF-kВ (RANK), остеопротегерин (OPG) и остеопротегерин-ліганд (OPGL, RANKL), були незалежно відкриті в кістковій та імунній системах [107, 108, 131, 167]. Дослідження, які було проведено на мишах, нокаутних за вказаними факторами, свідчать про те, що ця система необхідна для нормального розвитку і функціонування остеокластів, дендритних клітин, Т і В-лімфоцитів [136, 145]. По-третє, відомо, що у безтимусних мишей (nude) знижена швидкість ремоделювання кістки у порівнянні з нормальними тваринами [160]. Не виключена присутність у таких мишей закладки тимусу, однак все більше даних вказує на те, що кістковомозкові попередники можуть заселяти епітелій слизових оболонок, дозріваючи там без участі тимусу в функціональні Т-клітини. Значення позатимусного дозрівання Т-клітин у еутимічних тварин поки залишається незрозумілим [15, 38].
Основною моделлю, на якій проводяться дослідження функціональних можливостей тимусу з віком, є трансплантація його дорослому імунодефіцитному реципієнту. Однак, дані, отримані на такій моделі, не дозволяють в повній мірі оцінити весь комплекс впливів пересадженого тимусу, оскільки основні системи організму (нейроендокринна, кровотворна, кісткова, імунна) в дорослому організмі вже досягають значного рівня стабільності. Тому, в нашій роботі в якості реціпієнта використовувались новонароджені тварини з ще не установленими нейро-гуморальними зв'язками.
Експериментальну роботу виконано на мишах лінії СВА/Ca стадного розплідника Інституту геронтології АМН України. Встановлено, що ця лінія не є аутоімунною чи високораковою, їй не притаманна інша імунна патологія [4]. На першому етапі роботи для виявлення впливу тимектомії на щільність стегнової кістки було обрано тварин трьох вікових груп: новонароджені, двадцяти діб від народження та півторамісячного віку. В подальшому, на другому етапі роботи, в одному випадку використовували модель неонатальної тимектомії з трансплантацією тимусу 5-ти добового (молодого), в іншому - тимусу 24-х місячного (старого) тимусу під капсулу нирки 5-ти добових мишенят. Донорами тимусів були тварини 5 діб від народження (молоді) та віком 24 місяців (старі). Самцям трансплантувався тимус самців, самкам - тимус самок. Тварин брали для дослідження через 3-3,5 місяці після впливу. Основні дані про експериментальні групи наведені в зведеній таблиці експериментів 2.1.1.
Таблиця 2.1.1.
Розподіл тварин по експериментальним групам
Експериментальна групаВік тварин на момент операціїКількість тварин Тимектомія мишей у різному віці 3 доби
20 діб
1,5 міс77
33
39Трансплантація тимусу 5-добового донору тимектомованому реціпієнту5 діб34Трансплантація тимусу 24-місячного донору тимектомованому реціпієнту5 діб30Всього: 213
2.2. Методика експерименту
2.2.1. Методика проведення тимектомії.
Тимектомія проводилась мишенятам у проміжку 48-72 години від моменту народження. Відповідно рекомендаціям [72], мишеня охолоджували на льоду протягом 2-2,5 хв. Потім фіксували лейкопластирем до операційного столику черевом догори. Операційне поле обробляли 70 % спиртом. Розріз робили очним скальпелем уздовж лівої парастернальної лінії, починаючи від югулярної ямки до 4-го міжребірря. Рану розширяли очними гачками, підшкірні зв'язки і фасції відсепаровували пінцетом. Тимус видаляли за допомогою відсмоктувача медичного. Грудна клітина закривалася 2-3 шовковими вузловими швами. Рана оброблялась 70 % спиртом і заклеювалась клеєм БФ. Операційна смертність складала 10 - 20 %, рання післяопераційна - 20 % (за причин материнського канібалізму).
2.2.2. Методика проведення трансплантації тимусу мишей від 5-ти добового і 24-х місячного донорів.
Трансплантація тимусу проводилася на 5-ту добу життя мишеняти, тобто через 48 годин після тимектомії. За основу був взятий загальноприйнятий метод трансплантації тимуса під капсулу нирки [13, 233]. Однак, у зв'язку з тим, що капсула нирки 5-ти добового мишеняти погано помітна і слабка на міцність, було використано модифікацію цього методу з трансплантацією тимусу в навколонирковий простір зарання декапсульованої нирки реціпієнта [43]. Донорами були миші у віці 5-ти діб і 24-х місяців. 5-ти добовий донор охолоджувався на льоду протягом 5 хвилин. Потім фіксувався лейкопластирем до операційного столику черевом догори. Операційне поле обробляли 70 % спиртом. Розріз проводився за методом Cohn [72] ножицями, починаючи від пупка праворуч і ліворуч вверх до рівня ключиць крізь шкіру, м'язи і ребра з розтином грудної порожнини. Потім відділена ділянка передньої грудної стінки відводилася за нижній край доверху пінцетом. Тимус відділяли тупим шляхом, обережно витягували, очищали від зайвих тканин, розділяли на окремі долі і вміщували в чашки Петрі з охолодженим стерильним фізіологічним розчином.
Донорам старої вікової групи (24 місяці) робили евтаназію під ефірним наркозом. Потім мишей фіксували до парафінового столику голками догори черевом. Операційне поле обробляли 70 % спиртом. Розріз проводили ножицями, починаючи від югулярної ямки вниз уздовш стернальної лінії крізь шкіру, м'язи і грудину з проникненням в грудну порожнину. Тимус вилучали таким же чином, як і у новонароджених донорів.
Реціпієнти у віці 5-ти ді