ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальное исследование проведено на 372 белых беспородных лабораторных крысах-самцах, полученных из вивария Луганского государственного медицинского университета в единый сезонный период (июнь 2003). Животные содержались на типовом рационе, в стандартных условиях вивария на протяжении всего исследования, не более шести особей в одной клетке, в соответствии с правилами работы с лабораторными животными [91]. Все манипуляции с подопытными крысами выполнялись в соответствии с правилами Европейской конвенции защиты позвоночных животных, использующихся в экспериментальных и других научных целях [275] и были разрешены комиссией по биоэтике ЛугДМУ (протокол №6 от 26.04.2006г.). Ежедневное наблюдение за поведением и общим состоянием крыс каких-либо отклонений не выявило.
Подопытные животные были распределены в соответствии со схемой эксперимента (таб. 2.1). В зависимости от возраста мы разделили их на три равные серии. Первую серию составили неполовозрелые крысы в возрасте 5 недель от рождения с исходной массой 50-55 г. Вторую серию составили половозрелые крысы в возрасте 2,5 месяцев с исходной массой 130-150 г. Третью серию составили крысы периода старческих изменений в возрасте 11 месяцев с исходной массой 290-310 г. В зависимости от воздействия и продолжительности эксперимента животные каждой серии были подразделены на 5 групп (контрольная и четыре опытных, которые наблюдались 7, 15, 30 и 90 суток), по 6 особей в каждой. Мы выделили срок "30+60 дней" как период реадаптации для выяснения эффективности и продолжительности действия препаратов, в котором из 90 дней исследования лишь первые 30 дней крысы подвергались воздействию лекарственных средств.
Таблица 2.1.
Распределение животных по возрасту, виду воздействия и продолжительности эксперимента
Се-рия
ВозрастПродолжительность
эксперимента
(дни)Количество животных (группы)
Все-гоКонт-
роль-
наяОпытныеГДБГ+БІ
Неполовозрелые766_66241566_66243066_66249066_662430+60_6_6618ІІ
Половозрелые7666663015666663030666663090666663030+60_666624ІІІ
Старые766_66241566_66243066_66249066_662430+60_6_6618
Всего 372 особи
Г - гидрокортизон
Д - дексаметазон
Б - бисфосфонат "Зомета"
Г+Б - гидрокортизон + "Зомета"
Первую (контрольную) группу составили интактные животные, которые не подвергались воздействию каких-либо препаратов.
Крысы второй группы подвергались воздействию гидрокортизона ацетата в виде стандартной ампулярной 2,5% суспензии (серия №1720403 производства ВАТ "Фармак", г. Киев, регистрационный номер Р № UA/3288/01/01). Препарат вводился внутримышечно в дозе 21 мг ежедневно до 90 дня исследования и в течение 30 дней крысам из группы реадаптации.
Животные третьей группы репродуктивного возраста получали ампулярный 0,4% раствор дексаметазона гемисукцината (производства KRKA: VO2323 D, Словения), который вводился внутримышечно в дозе 1,07 мг в режиме, аналогичном введению гидрокортизона.
Поскольку гидрокортизон и дексаметазон находятся достаточно длительно в активном состоянии в организме, влияя на гормональную активность надпочечников, в эксперименте учитывали циркадные ритмы организма подопытных животных, в связи с этим глюкокортикоиды вводились в первой половине суток [234].
Особенность данного эксперимента заключается в том, что в организме подопытных животных в результате назначенных инъекций гидрокортизона и дексаметазона создавалась такая концентрация глюкокортикоидов, которая соответствует эндогенному физиологическому пику секреции этих гормонов в утренние часы или в моменты стресса, то есть оба глюкокортикоида вводились в дозах, балансирующих на верхних границах нормы [234]. Избыточное содержание их в организме крыс создавалось за счет ежедневного введения данных препаратов. Минимальные терапевтические дозы глюкокортикоидов, используемые в клинической практике при хронических процессах для длительной поддерживающей терапии, колеблются от 25 мг до 50 мг для гидрокортизона и от 1мг до 3 мг для дексаметазона [78]. Учитывая, что в клинической практике чаще всего применяется преднизолон, пересчет от используемых глюкортикоидов к преднизолону произведен согласно рекомендации Европейского симпозиума по глюкортикоидной терапии [251], утвердившей "преднизоновый эквивалент": 7,5 мг преднизолона (преднизона) по химической активности соответствует 21 мг гидрокортизона и 1,07 мг дексаметазона.
Животные четвертой группы получали бисфосфонат пятого поколения - золедронат - лиофилизат золедроновой кислоты ("Зомета", производства Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland, регистрационный номер в Украине Р.06.01./03.164, серийный номер 993 931.4-983/20 es), в дозе 0,362 мг/кг внутрибрюшинно 1 раз в 30 дней. Для того чтобы учесть видовые различия в скорости метаболизма человека и крысы, "Зомета" дозировалась по константе биологической активности [163]:
Доза крысы = (r x средняя терапевтическая доза человека, мг/кг) / R
где r = 3,62 - коэффициент видовой резистентности крысы;
R= 0,57 - коэффициент видовой резистентности для человека.
Рекомендуемая производителем Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland, среднетерапевтическая доза для человека - 4 мг на инъекцию 1 раз в 30 дней из расчета на 70 кг веса, что составляет 0,057 мг/1000г. Доза крысы = (3,62?0,057):0,57=0,362 мг/1000г/мес. Инъекции производились на 1, 29, и 60 сутки исследования. Поэтому животные всех возрастных периодов, которые выводились из эксперимента на 7 и 15 сутки получили одну дозу бисфосфоната, а животные, которые забивались на 30 и 90 сутки наблюдения получили две и три дозы, соответственно. В группе реадаптации крысы получили две дозы золедроната (на 1 и 29 сутки) и наблюдались до 90 дня исследования.
Крысам пятой группы вводили совместно два препарата - гидрокортизон и "Зомету" в тех же дозах
- Київ+380960830922