РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження
Для вирішення поставлених задач було проведено, крім клінічного спостереження, визначення вмісту нітратів та нітритів у сироватці крові вагітних, кардіотокографічне дослідження (КТГ), ультразвукове дослідження з включенням ультразвукової фетометрії та плацентометрії, дослідження кровотоку в системі мати-плацента-плід за допомогою допплерометрії, а також клініко-статистичне порівняння ефективності різних способів лікування НВ.
Поряд з вище перерахованими дослідженнями, були проведені стандартні клінічні та лабораторні дослідження згідно Наказу МОЗ України №620 від 29.12.2003 р. "Про організацію надання акушерсько-гінекологічної та неонатологічної допомоги в Україні", зокрема загальний аналіз крові та сечі, визначення групової та резус-належності, дослідження крові на ВІЛ-інфекцію, вірусний гепатит В та сифіліс, мікроскопічний аналіз урогенітальних виділень та обстеження на TORCH-інфекції.
На кожну вагітну, яка знаходилась під нашим спостереженням, заповнювали спеціально розроблену карта, в яку були включені дані загального та акушерсько-гінекологічного анамнезу, відомості про перебіг даної вагітності, результати клініко-лабораторних і функціональних досліджень та застосовані схеми лікування і профілактики невиношування, дані про перебіг пологів та стан новонародженого.
Останнім часом багато дослідників надають особливого значення концепції гетерогенності чинників, що призводять до невиношування вагітності, вказуючи, що в основі більшості з них лежить підвищення маткової активності.
На сьогодні встановлено, що у регуляції маткового тонусу та пролонгації вагітності важливу роль відіграє саме оксид азоту [74, 79, 94]. Визначення рівня оксиду азоту як модулятора маткових скорочень у вагітних, встановлення достовірного зв'язку між оксидом азоту та розвитком НВ, на нашу думку, дозволило б по-новому підійти до розробки схем прогнозування, профілактики та лікування даної патології.
Відомо, що оксид азоту утворюється з амінокислоти L-аргініну під впливом NO-синтази. При цьому, крім NO, одночасно синтезується неактивна сполука L-цитрулін, який потім рециркулює, поповнюючи внутрішньоклітинні запаси аргініну. Частина цитруліну, потрапляючи до печінки, перетворюється у сечовину, а інша його частина, потрапляючи у нирки, знову перетворюється у L-аргінін [9].
NО вступає у контакт з тканинами, не потребуючи рецепторів, легко проникаючи через мембрану клітин. Завдяки цьому активність NO системи можна визначати за рівнем NO в крові, без необхідності вивчення його активності на рецепторному рівні з урахуванням теорії про кількість рецепторів та рецепторну перехресну дію.
Однією з особливостей оксиду азоту є те, що це короткоживуча молекула, яка відносно швидко (6-10 с) інактивується, перетворюючись у нітрати (NO3) та нітрити (NO2) [12].
Саме тому визначення рівня оксиду азоту проводилось шляхом вимірювання у сироватці крові вагітних нітратів та нітритів, як кінцевих продуктів метаболізму оксиду азоту, модифікованим методом Грісса [25,26]. Вивчення рівня нітратів та нітритів у сироватці крові здійснювали у вагітних контрольної групи, у вагітних І-ІІІ груп з невиношуванням вагітності до початку лікування та у процесі лікування та вагітних ІV групи.
Слід зазначити, що в організмі нітрити знаходяться у вигляді слідів, малі концентрації нітритів окислюються у нітрати [26]. Тому для нашого дослідження має значення саме вміст нітратів у сироватці крові.
Дослідження проводилось на плашковому спектрофотометрі "Яхонт-01" (Санкт-Петербург, Росія) з використанням реактивів фірми "Sigma".
Для цього з метою осадження білка до 2 мл сироватки крові додавали 0,5 мл насиченого Ва(ОН)2 та 0,2 мл 20% ZnSO2. Ретельно перемішували та давали відстоятися 2-3 хв. Потім центрифугували при 3000 g. Для подальших досліджень використовували надосадову рідину.
Для визначення нітриту до 200 мкл зразка, що досліджувався, додавали 20 мкл концентрованої HCL та 20 мкл 37,5 мМ водного розчину сульфанілової кислоти. Через 3 хв. додавали 20 мкл 0,1% водного розчину n-1-нафтилетилендіамінгідрохлориду (NED). Через 40 хв. вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 540 нм. Кількість нітриту визначали за калібрувальним графіком.
Для визначення нітратів спочатку відновлювали нітрати до нітритів, використовуючи кадмієві колонки.
На дно колонки поміщали шар фільтрувального паперу, колонку заповнювали водою та вносили суспензію кадмію порцеляновою ложечкою до висоти 2,5-3 см. При заповненні колонки давали воді періодично стікати, щоб рівень води не опускався нижче поверхні кадмію. Шар кадмію періодично перемішували скляною паличкою, щоб у колонці не залишалось пухирців газу. Швидкість елюції не повинна перевищувати 3-5см3/хв. Перед кожним дослідження кадмій заливали на ніч 0,1N НCL для відновлення, після чого відмивали дистильованою водою.
Для перепідготовки колонки послідовно промивали 3 мл дистильованої води та 3 мл аміачного буфера (рН 9,8), розведеного у 10 разів. Потім колонки переносили в інші пробірки та пропускали через них послідовно 1 мл розчину зразка, що досліджувався, 0,25 мл аміачного буфера (рН 9,8) та 0,75 мл дистильованої води.
Перед проведенням аналізу перевіряли відновлювальну здатність кадмієвої колонки. Для цього пропускали через колонку стандартний розчин нітрату. Потім проводили вимірювання нітриту за вказаним вище методом. Кількість нітриту та нітрату визначали за калібрувальним графіком. Якщо вміст нітриту менше 90% колонку слід регенерувати.
Для оцінки внутрішньоутробного стану плода та скоротливої діяльності матки з метою діагностики НВ та контролю ефективності і безпечності лікування проводили кардіотокографію за допомогою кардіотокографа Hewlett Packard Series 50A та Feta Care "Kranzbuhler".
Моніторна реєстрація частоти серцевих скорочень плоду здійснювалась одночасно з записом токограми. Аналіз кардіотокограми (КТГ) проводився за допомогою виз
- Київ+380960830922