РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Для вирішення поставлених задач у нашому дослідженні використано клініко-анатомічний матеріал 134 хворих, який отримано під час операцій (гістеректомія, конізація шийки матки) і діагностичних біопсій (кольпоскопія з прицільною біопсією) з приводу цервікальних інтраепітеліальних неоплазій шийки матки (CIN), інвазивних раків шийки матки (плоскоклітинних та аденокарцином різного ступеня диференціювання), цервіцитів, ендоцервікозів та інших гінекологічних захворювань, що не пов'язані з патологією шийки матки з обласного онкологічного диспансеру, міських клінічних лікарень № 19, 4 м. Дніпропетровська, обласної клінічної лікарні ім. І.І.Мечникова, поліклініки Дніпропетровської державної медичної академії в період з 1999 по 2007р. Середній вік пацієнток з ЦІН складав 37,43?1,23 років, з інвазивними раками 60,23?1,05 років.
Весь клініко-анатомічний матеріал був розподілений на 3 групи (табл. 2.1):
1 група - пацієнтки з ЦІН І (дисплазія легкого ступеня, Н-ПІУ), ЦІН ІІ (дисплазія помірного ступеня, В-ПІУ), ЦІН ІІІ (дисплазія тяжкого ступеня та рак на місці, В-ПІУ) у віці від 18 до 65 років. Матеріал представлено гістологічними препаратами;
2 група - пацієнтки з інвазивними раками шийки матки у віці від 30 до 70 років на стадіях від I B до IV A, згідно класифікації міжнародної федерації акушерів та гінекологів. Ступінь диференціювання визначався згідно ВООЗ критеріїв. Матеріал представлено гістологічними препаратами;
3 група - пацієнтки з патологією шийки матки, яка не була пов'язана з ЦІН або новоутвореннями шийки матки у віці від 25 до 60 років - як контроль. Розподіл матеріалу, у залежності від форми захворювання, був наступним: цервіцит - 2, нормальний епітелій шийки матки - 5.
Таблиця 2.1
Загальний розподіл клінічного матеріалу
Гістологічний діагнозКількість спостережень%ЦІН І3022,4ЦІН ІІ2921,6ЦІН ІІІ3223,9Плоскоклітинні раки: зроговілі 1813,4 незроговілі96,7Аденокарциноми: високодиференційовані64,6 низькодиференційовані32,2Контрольна група75,2Всього134100,0
На початку нашого дослідження був відібраний матеріал 156 пацієнток, після детального аналізу матеріал 22 пацієнток був виключений через недостатність матеріалу, залишеного у парафінових блоках, відсутність даних ПРЛ на предмет наявності вірусів папіломи людини високого канцерогенного ризику. Матеріал 5 пацієнток було вилучено через неможливість проведення імуногістохімічного дослідження через неправильну обробку післяопераційного та біопсійного матеріалу.
2.2. Методи дослідження
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний комплекс методів морфологічного, імуногістохімічного, морфометричного, статистичного аналізу та метод ПЛР.
2.2.1. Морфологічні методи дослідження
Для проведення морфологічного дослідження операційний і біопсійний матеріал хворих з діагнозом "дисплазія низького ступеня", "дисплазія середнього ступеня", "дисплазія тяжкого ступеня", "інвазивний плоскоклітинний рак", "аденокарцинома", "прогресуючий ендоцервікоз", "ендоцервіцит" фіксувався в 10% розчині нейтрального забуференного формаліну на протязі 12 годин з метою збереження цілісності клітин і тканин, оскільки фіксація в кислому формаліні нерідко викликає ушкодження антигенних детермінант, які необхідно зберегти для подальшого імуногістохімічного дослідження. Після фіксації і проводки по стандартній методиці матеріал заливався у парафін. Парафінові зрізи, після фарбування гематоксиліном-еозином, піддавалися ретельному мікроскопічному дослідженню. Світлова мікроскопія проводилася за допомогою світлового мікроскопу Leіca DMLS з використанням об'єктивів Ч10, Ч20, Ч40, Ч100. Гістологічний діагноз встановлювався у відповідності з гістологічною класифікацією пухлин та пухлиноподібних станів шийки матки ВООЗ 1994р [114].
2.2.2. Імуногістохімічні методи дослідження
Говорячи про основні принципи імуногістохімії, варто підкреслити, що вона дозволяє ідентифікувати антигенні субстанції клітин і тканин на основі специфічної взаємодії антигену й антитіла, що виявляється завдяки відповідній мітці на світлооптичному чи ультраструктурному рівнях.
Дана методика заснована на з'єднанні строго специфічного моноклонального антитіла із антигенними детермінантами, які необхідно знайди. Виняткова спорідненість авідіну, відносно великого протеїну, який отримують з яєчного білка, до біотину, що являє собою вітамін з низькою молекулярною вагою дозволяє домогтися дуже високої тропності, яка вище константи спорідненості найпотужнішої реакції антиген-антитіло. Комплекс авідін-біотинільованої пероксидази і біотинільованого вторинного антитіла може бути досить великим і, що більш важливо, містить безліч ензимоактивних молекул пероксидази. Цей фермент, виділений з кореня хрону, розщеплює перекис водню. Активність ендогенної пероксидази блокували специфічною сироваткою, що входить до складу системи візуалізації. Метод виявлення активності пероксидази заснований на фарбуванні хромогену, що виступає в ролі донора електронів, у присутності перекису водню. Як хромоген ми використовували DAB - 3-диаминобензидина тетрахлорід (продукт реакції коричневого кольору, нерозчинний в органічних барвниках) [29, 85].
Зрізи товщиною 4-5 мкм наносили на предметні стекла, попередньо оброблені адгезивною рідиною (poly-L-lysіne), слідом за чим депарафінізували відповідно до прийнятих стандартів. Фіксація матеріалу має особливе значення для імуногістохімії - при фіксуванні кислим формаліном спостерігається стійке зв'язування антигенних детермінант. Нівелювати цей дефект можливо, застосувавши фіксацію в нейтральному забуференному формаліні з наступним проведенням теплової індукції епітопного (антигенного) звороту (HІER - heat іnductіon of epіtope retrіeval). Ми використовували нагрівання на водяній бані в цитратному буфері з рН=6.0 (на протязі 30 хвилин після досягнення температ