РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження.
При обстеженні пацієнток з'ясовувалися скарги, анамнез захворювання, сексуальний анамнез. Проводився огляд зовнішніх статевих органів, огляд в дзеркалах і бімануальне дослідження внутрішніх статевих органів, кольпоскопія. Проводилося комплексне клініко-лабораторне обстеження хворих.
Всі лабораторні дослідження, показники місцевого і системного імунітету в групах хворих проводилися до лікування, одразу після закінчення курсу терапії і через місяць після курсу лікування. Всі хворі піддавалися серологічному обстеженню на сифіліс і ВІЛ.
Всім пацієнткам проводився розгорнутий аналіз крові (з визначенням кількості формених елементів крові і лейкоцитарної формули) і сечі. Як первинний матеріал від жінок використовувався зшкрібок з цервікального каналу і слизової уретри шляхом взяття мазка із забарвленням метиленовим синім і за Грамом. Дослідження препарату здійснювали за допомогою світлової мікроскопії під імерсією при 900-кратному збільшенні мікроскопа. Оцінювали клітинний склад мазка, визначали наявність патогенної і умовно-патогенної флори. Критерієм запального процесу в цервікальному каналі і уретрі з'явилося підвищення лейкоцитів понад 7-10 в полі зору.
У всіх випадках для виключення гонококової інфекції, після комбінованої провокації (біологічна, хімічна, аліментарна) проводилося бактеріоскопічне і бактеріологічне обстеження. Для виявлення трихомонад досліджувалися нативні і забарвлені 1% водним розчином метиленового синього препарату, посів виділень на живильні середовища.
Діагностику хламідійної інфекції проводили двома методами: з використанням моноклональних антихламідійних антитіл і полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з відповідними тест-системами.
Діагностику інфікованості уретри Ureaplasma urealyticum (U.u.) і Mycoplasma hominis (M.h.) проводили 3 методами [29]:
- культуральний метод - стандартні проби "Mycoplasma DUO" фірми "Sanofi Pasteur" (Франція), також визначалася чутливість мікоплазм до різних антибіотиків. Вирощування мікоплазм проводили в термостаті при температурі 36-37єС. Результати враховувалися через 24 години для U.u. і 48 годин для M.h. При зростанні мікоплазм лужні продукти, що утворюються, завдяки наявності індикатора змінюють колір середовища від початкового жовтого до рожевого. Зміна кольору відбувалася звичайно у всьому стовпчику рідини без осаду і помутніння. Перевагою даних тест-систем був облік мікоплазм як в якісному, так і в кількісному (КУО) варіанті;
- метод виявлення антигенів U.u. і M.h. в реакції прямої імунофлюоресценції. Забір матеріалу проводили із слизової уретри одноразовим зондом або ложкою Фолькмана. Мазок висушували, фіксували 96% етанолом протягом 5 хвилин. Мічені мікоплазменні антитіла наносили на мазок мікропіпеткою в об'ємі 30 мкл, інкубували в термостаті при 37єС протягом 15 хвилин. Вмонтовували препарат в забуференному до рН 7,5-8,5 гліцерином, мікроскопували в люмінісцентному мікроскопі. Уреаплазми і мікоплазми виявлялися у вигляді поліморфних структур, що мають яскраво-зелене свічення, розташованих на поверхні епітеліальних клітин, а також вільно. Неспецифічна бактеріальна мікрофлора, клітини епітелію і лейкоцити забарвлювалися в жовто-гарячий і червоно-бурий кольори;
- метод ПЛР за допомогою відповідних тест-систем, що містять високоспецифічні ліганди, до певного ДНК U.u. і M.h.
Діагностика наявності M.g. проводилася тільки методом ПЛР, оскільки інших діагностичних систем для ідентифікації даного виду мікоплазм немає.
Імунний процес, що протікає в організмі, супроводжується 2 типами реакцій: специфічними, визначаючими формування імунної відповіді і неспецифічними (антигензалежними) змінами реактивності організму. Багатокомпонентний характер імунної відповіді, складність взаємостосунків і механізмів реагування його складових, є віддзеркаленням головного напряму цих реакцій - збереження антигенного гомеостазу організму, порушення якого може бути зумовлено проникненням чужерідних субстанцій, в даному випадку мікоплазм. В клінічній практиці в даний час широко застосовуються методи виявлення різних популяцій і субпопуляцій лімфоїдних клітин. Їх належність до тієї або іншої групи визначається по наявності специфічних антигенних детермінант, що знаходяться на клітинній поверхні клітин. Для підрахунку і моніторингу лімфоцитів в периферичній крові лімфоїдних клітин в слизовій уретри і цервікального каналу застосовували метод прямої імунофлюоресценції з використанням мічених мишачих моноклональних антитіл. Для виділення мононуклеарних клітин з венозної крові використовували центрифугування на градієнті густини фіколверографін d=1,078. Забарвлення міченими антитілами і відмивання клітин проводили в мікропланшетах. Для ідентифікації популяції Т-лімфоцитів використовували СD3-антитіла; субпопуляції хелперно-індукторних і цитотоксичних лімфоцитів виявляли відповідно з анти-СD4+ і анти-СD8+ моноклональними антитілами. Для підрахунку В-клітин в периферичній крові і їх ідентифікації в зшкрібках слизової уретри використовували анти-СD19+ антитіла, які, як відомо, реагують зі всіма В-лімфоцитами. Вміст NK-клітин визначали за допомогою анти-СD16+ антитіл. Крім того, для визначення потенційної здатності лімфоцитів до активації і диференціювання під впливом поліклонального стимулятора IL-2, визначали кількість клітин, що експресують на своїй поверхні мембранний рецептор до даного інтерлейкіну, тобто СD25+. Останніми роками показано, що при активації будь-якої клітини лімфоїдного ряду на її мембрані з'являється антиген СD69+. У зв'язку з цим, при реакції даних клітин з моноклональними антитілами анти СD69+ можна визначити лімфоцити, що покояться і активовані [60].
Концентрацію імуноглобулінів основних класів (IgG, IgM, IgA) в сироватці крові визначали методом радіальної імунодифузії [60].
Фагоцитарну активність нейтрофільних лейкоцитів периферичної крові визначали за наступними критеріями:
- фагоцитарна активність лейкоцитів (ФАЛ) - відсоток активних фагоциті
- Київ+380960830922