РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Утримання лабораторних тварин в умовах експерименту та розподіл їх на групи
Всі експерименти були проведені відповідно з існуючими міжнародними вимогами і нормами гуманного відношення до тварин.
Досліди були проведені на безпородних білих щурах-самцях вагою (на початок експерименту) 125-140 г. У щурів, що поступали, проводили карантин за всіма правилами зоогігієни [249]. Тварин утримували у світлому приміщенні з постійною температурою повітря 20-250 С й вологістю 40-45%. Клітки щоденно прибирали і раз у тиждень дезінфікували крутим окропом і 5-10%-им розчином їдкого лугу. Корм тварин складали з розрахунку добової потреби. Для щурів у середньому ця потреба складає 30-32 г, з яких 25 г змішаного корму і 5-7 г овочів. До змішаного корму входив комбікорм: пшениця, овес, ячмінь, просо та інші зернові. З овочів тваринам давали коренеплоди, а також траву доброї якості, салат. Така зерново-овочева дієта була збалансована не тільки по білкам-жирам-вуглеводам, але й по мінеральним речовинам та вітамінам. У питній воді щурів не обмежували, воду давали тільки свіжу і чисту.
Для отримання гетерогенності емоційно-стресових реакцій і їх порівняння у тварин різних груп проводилось попереднє тестування тварин з метою виявлення індивідуальних паттернів їх поведінки [264]. Крім того ми намагались застосовувати тварин з більш-менш однорідним генотипом (від одних батьків).
В першу групу ввійшли контрольні тварини (n=35).
Друга група (n=33) була подана тваринами, яким створювали стресову зооконфліктну ситуацію шляхом обмеження життєвого простору до 8,0-10,0 см2 на одну тварину. Це досягалося тим, що в стандартну клітину розміром 0,3х0,5 м. [250], де повинно утримуватись 2-3 тварини, розміщували 20-22 щура. Для тварин цього виду така ситуація служить сильним стресовим фактором [251, 252]. Цей фактор через активацію симпатичного відділу вегетативної нервової системи призводить до підвищеної секреції гормонів наднирників (в першу чергу глюкокортикоїдів та адреналіну).
Всі наступні групи були представлені тваринами, які паралельно зі створеною стресовою зооконфліктною ситуацією отримували речовини, які певним чином модулювали синаптичну передачу у гіпоталамусі. Так, тварини третьої групи (n=21) отримували 5-(3-диметиламіно-пропіліден)-10,11-дигідродибензоциклогептену гідрохлорид у дозі 5 мг/кг/ доба [253-255]. Фармакологічна назва - амітриптилін, яка й надалі буде фігурувати в нашій роботі для полегшення сприйняття. Для тварин четвертої групи (n=21) застосовували 3,4,5-триметоксі-бензоат метилрезерпат. Фармакологічна назва - резерпін. Добова потреба цього препарату становила 5 мг/кг/доба [256-257]. Тварини п'ятої групи (n=21) отримували 1-(гідрозинокарбоніл)метил-7-бром-5-фенил-1,2-дигідро-3Н-1,4-бенздіазепін-2-ОН, синтетичний психотропний засіб у дозі 25 мг/кг/добу [243, 248, 258]. Фармакологічна назва - гідазепам, яка й надалі буде фігурувати в нашій роботі для полегшення сприйняття. Всі фармакологічні речовини щурам досліджуваних груп вводили перорально вранці (800 - 1000), натще. Об'єм розчинених препаратів, чи фізіологічного розчину (для тварин контрольної групи та тих, що підлягали дії стресу) складав 1 мл.
2.2. Реєстрація біоелектричної активності щурів як показника морфофункціонального стану гіпоталамусу за умов експерименту
У нашій роботі при гострому експерименту ми проводили реєстрацію біоелектричної активності різних зон гіпоталамусу за допомогою стереотаксичного методу відведення біопотенціалів [259] кожні 3 тижні, тобто через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 тиждень паралельно у тварин всіх досліджуваних груп. Кількість тварин на кожному тижні у певній експериментальній групі дорівнювала 3-5. До того ж, з кожної досліджуваної зони гіпоталамус щура реєстрували по 10-12 записів сумарної електричної активності. Як відомо [311], для більшості біологічних показників, які використовують у дослідженнях, мінімальна кількість спостережень становить 25. Також такий підхід є зручним для клінічної практики [312]. У нашому дослідженні у кожній експериментальній групі через кожні 3 тижні було зафіксовано як мінімум 30-36 записів сумарної електричної активності з даних зон гіпоталамусу. Після кожного експерименту проводили ідентифікацію локалізації електродів на фронтальних зрізах головного мозку [259]. Дана процедура дозволила зменшити кількість "зайвих" записів у подальшій статистичній обробці даних, тим самим забезпечуючи достовірність отриманих результатів.
Хірургічна процедура підготовки до експерименту виконувалась під дією наркозу: 2-(орто-хлорфеніл)-2-(метиламіно)-циклогексанону гідрохлорид, або кетаміну гідрохлорид (20 мг/кг) та тіопенталу натрію (50 мг/кг) [260-261]. Розчин наркозу вводили інсуліновими шприцами у черевну порожнину щура в районі задніх кінцівок, причому спочатку вводили тіопентал натрію, а через 5 хвилин - кетамін.
Застосування різних неінгаляційних речовин загальної анестезії, з практичної точки зору, базувалось на різному їх впливі на організм. Так, тіопентал натрію (Thiopental sodium) у терапевтичних концентраціях посилює ефект гама-аміномасляної кислоти (ГАМК), викликає гіперполяризацію мембран нейронів. Високий вміст тіопенталу в мозку спостерігається в першій фазі розподілу й зумовлює стан наркозу. В наступні 10-20 хв. відбувається перерозподіл наркотику і до 80% його переходить в органи з відносно бідним кровопостачанням (шкіра і підшкірна клітковина, інші жирові депо, скелетні м'язи та ін.). В результаті концентрація тіопенталу в мозку різко падає і наступає пробудження тварини. Кетамін (Ketamine; 2-(орто-хлорфеніл)-2-(метиламіно)-циклогекса-нону гідрохлорид) є антагоністом збуджуючої глутамінової кислоти у ЦНС: він блокує один із рецепторів глутамату і завдяки цьому пригнічує ЦНС. Його вводили через 5-7 хвилин після тіопенталу натрія, так як він має загальний анестезуючий та анальгезуючий ефекти із швидкою і нетривалою дією. Кетаміновий наркоз називають "