РОЗДІЛ 2
Об’єкт, матеріали і методи досліджень
2.1. Штами дріжджів, культивування та техніка проведення експериментів
Штами дріжджів та їх генетична характеристика. Штами дріжджів Saccharomyces
cerevisiae, які були використані в роботі, люб’язно надані: YPH250, YPH250
(Дyap1), YTT7, YIT2, YWT1 – професором Й. Інуе (Кіотський інститут сільського
господарства, Японія); EG103, EG110, EG118 – професором E.Б. Гралла
(Каліфорнійський університет, Лос-Анжелес, США); YPH98 – професором M.Б.
Toледано (Центр біохімії і молекулярної генетики, Гіф-сюр-Іветт, Франція).
Генотип штамів наведено у табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Генетична характеристика штамів S. cerevisiae
Штам
Генотип
YPH250
MATa trp1-Д1 his3-Д200 lys2-801 leu2-Д1 ade2-101 ura3-52
YPH250 (Дyap1)
так, як в YPH250, але yap1::HIS3
YTT7
так, як в YPH250, але ctt1::URA3
YIT2
так, як в YPH250, але cta1::TRP1
YWT1
так, як в YPH250, але cta1::TRP1 ctt1::URA3
YPH98
MATa ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Д1 leu2-Д1
EG103
MATб leu2-3,112 his3Dl trp1-289a ura3-52
EG110
так, як в EG103, але sod2::TRP1
EG118
так, як в EG103, але sod1::URA3
Детальніше генетичні особливості досліджуваних штамів охарактеризовано в табл.
2.2.
Таблиця 2.2
Генетичні дефекти штамів, використаних у роботі
Назва гену
Білок, який кодується даним геном
TRP1
N-(5?-фосфорибозил)-антранілатізомераза [КФ 5.3.1.24]
HIS3
Імідазолгліцерофосфатдегідратаза [КФ 4.2.1.19]
ADE2
Фосфорибозиламіноімідазолкарбоксилаза [КФ 4.1.1.21]
LYS2
Дегідрогеназа аміноадипінового напівальдегіду [КФ 1.2.1.31]
LEU2
3-ізопропілмалатдегідрогеназа [КФ 1.1.1.85]
URA3
Оротидин-5?-фосфатдекарбоксилаза [КФ 4.1.1.23]
CTA1
Пероксисомна каталаза, або каталаза А [КФ 1.11.1.6]
CTT1
Цитозольна каталаза, або каталаза Т [КФ 1.11.1.6]
SOD1
Цитозольна Cu,Zn-вмісна супероксиддисмутаза [КФ 1.15.1.1]
SOD2
Мітохондріальна Mn-вмісна супероксиддисмутаза [КФ 1.15.1.1]
YAP1
Транскрипційний фактор Yap1
Реактиви. У роботі використовували реактиви виробництва „BioGene”
(Великобританія), „Sigma Chemical Co.” (США), „Reanal” (Угорщина), „Fluka”
(Німеччина), „Реахім” (Росія). Решта реактивів – вітчизняного виробництва класу
не нижче ч.д.а.
Умови культивування S. cerevisiae. Штами дріжджів S. cerevisiae зберігали на
скошених сусло-агарових середовищах (2% агару).
Клітини культивували в рідкому напівсинтетичному живильному середовищі YPD, яке
містило 1% глюкози, 2% пептону і 1% дріжджового екстракту. Нічну культуру
вирощували протягом 22-26 годин (стаціонарна культура) в умовах глибинного
культивування при температурі 28єС. Для досліджень відповідний об’єм нічної
культури розводили стерильним середовищем такого ж складу у співвідношенні 1:50
(в експериментах зі стаціонарними культурами) і 1:300 (в експериментах з
експоненційними культурами) і вирощували в умовах аерації на шейкері (120
коливань за хвилину) при 28єС до досягнення необхідної фази росту.
В експериментах, в яких оцінювали виживання клітин, посів дріжджів здійснювали
на чашки Петрі з сусло-агаровим середовищем (2% агару).
Перед використанням живильні середовища стерилізували автоклавуванням при
температурі 115°С і тиску 0,7 атм. протягом 45 хв.
Криві росту. Через певні проміжки часу після пересіву в стерильних умовах
відбирали 2 мл суспензії дріжджів і реєстрували її оптичну густину на
спектрофотометрі „Spekol 211” (Німеччина) при довжині хвилі 600 нм. Приріст
кількості клітин виражали як функцію величини розсіювання світла суспензією
дріжджів. Оптична густина культури дріжджів на середині експоненційної фази
росту (через 8-11 годин) становила 0,5-0,6 одиниць, на стаціонарній фазі (через
24-25 годин) – 1,6-1,9 одиниць, що відповідало концентрації клітин в суспензії
9-11Ч106 кл/мл і 120-140Ч106 кл/мл відповідно.
Визначення концентрації глюкози в середовищі культивування. Концентрацію
глюкози визначали ензиматичним методом, який ґрунтується на специфічному
окисленні глюкози під дією глюкозооксидази [13]. При окисленні глюкози
утворюється еквімолярна кількість пероксиду водню, який у присутності
пероксидази окислює 3?,3-диметоксибензидин (о-діанізидин). Відновлений
о-діанізидин (безбарвний) перетворюється в окислений о-діанізидин (забарвлений
у червоний колір) з максимумом поглинання при 435 нм. Робочий реактив для
визначення глюкози містив (у 100 мл): 0,25 мМ ацетатного буферу (рН 4,8), 1%-ий
розчин о-діанізидину (приготовлений на 3,8%-ій HCl), 1 мг кристалічного
препарату пероксидази хрону і 1 мг кристалічного препарату глюкозооксидази. До
0,5 мл зразка, що містив не більше 250 мкг глюкози, додавали 1,5 мл робочого
реактиву, інкубували 20-30 хвилин до появи оптимального забарвлення, після чого
визначали поглинання пробою світла при довжині хвилі 435 нм на спектрофотометрі
„Spekol 211”. Вміст глюкози в досліджуваних пробах визначали за допомогою
калібрувального графіка, побудованого зі стандартним розчином глюкози (0,5
мг/мл).
Моделювання умов голодування для культур дріжджів. У даних експериментах
використовували штами дріжджів YPH250 і YWT1. Після досягнення стаціонарної
фази росту (24 год, OD600 1,6-1,9) клітини дріжджів у стерильних умовах збирали
центрифугуванням при 5000 g протягом 5 хв. Осаджені клітини ресуспендували в
стерильній дистильованій воді і переносили в стерильні колби Ерленмейера. У
дистильованій воді клітини витримували 4 доби при 28єС.
Підрахунок концентрації клітин в культурах дріжджів. Концентрацію клітин у
суспензії дріжджів визначали за допомогою лічильної камери Горяєва. Для
рівномірного розподілу клітин у всьому об’ємі суспензію дріжджів перемішували,
потім відбирали 10 мкл суспензії, якою заповнювали одну з камер. Клітини
підраховували під світловим мі
- Київ+380960830922