РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ, ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та тест-системи досліджень
В роботі використані метильні похідні N-оксид піридину і їх комплекси з
протонодонорами синтезовані в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН
України й рекомендовані в якості регуляторів росту рослин та похідні піридину.
З метою відбору найменш небезпечних речовин для подальших випробувань і
впровадження в сільське господарство їх в якості регуляторів росту рослин
проведений скринінг гострої токсичності і кумулятивних властивостей деяких
похідних піридину та N-оксид піридину і їх комплексів з протонодонорами на
лабораторних тваринах (щури та миші) і одноклітинних простіших – інфузоріях
Tetrahymena pyriformis W.
Визначення залежності «доза-час-ефект» та характеру «парадоксальних ефектів» за
умов тривалої дії проводили in vitro - на інфузоріях Tetrahymena pyriformis W
та in vivo - на щурах самках лінії Wistar в широкому діапазоні концентрацій і
доз.
Вибір тест-системи in vitro базувався на тому, що cеред одноклітинних
організмів, зокрема, найпростіших Protozoa - інфузорії Tetrahymena pyriformis
W. найбільш широко використовуються в токсикології як альтернативний об‘єкт для
дослідження токсичності й мутагенної активності багатьох полютантів водного
середовища, пестицидів, важких металів, витяжок з полімерних матеріалів,
консервуючих добавок та дезінфекційних засобів, органічних і неорганічних
сполук [179 - 185]. Цінним є те, що за короткий проміжок часу є можливість
визначити біологічну відповідь на вплив хімічних речовин на цілісному
одноклітинному організмі. Крім того, для більшості речовин установлена майже
повна ідентичність функції кута нахилу прямої летальності для інфузорій і
лабораторних тварин, що дає можливість екстраполювати результати досліджень з
найпростіших на тварин і людину [14,186].
Дослідження гострої токсичності речовин проводили на статевозрілих щурах самцях
лінії Wistar і безпородних мишах самцях. Оскільки за впливу похідних піридину й
N-оксид піридину не спостерігається видової й статевої чутливості, то в якості
тест-системи в субхронічних дослідженнях обрані щури як основна
експериментальна модель в токсикології. Перевага самкам щурів, в наданій
роботі, віддана в зв‘язку з фізіологічними особливостями їх організму
(наявність циклічних періодів – еструсу), що дасть більшу імовірність виявити
біологічні ефекти за умов впливу ксенобіотиків на рівні низьких доз.
Статевозрілі щури лінії Wistar і білі миші отримували із розплідника тварин
фірми ТОВ "Далі" (м. Київ). До початку експериментів упродовж 14 діб тварин
утримували в карантині у віварії Інституту екогігієни і токсикології ім.
Л.І.Медведя МОЗ України. Піддослідні й контрольні тварини утримувались у
приміщенні при температурі 21 ± 22 0С, відносній вологості повітря 40-60 %
[187]. Раціон складався з концентрованого гранульованого комбікорму та овочів і
відповідав нормам, установленим Наказом МОЗ СРСР № 1179 від 10.10.1988 р.,
питна вода відповідала ГОСТ 2874-82.
2.2. Дослідження токсичних властивостей речовин при однократній дії в умовах in
vivo та in vitro
При виборі доз препаратів, терміну досліджень, способу введення в організм
лабораторних тварин і експозицій керувались Методичними вказівками щодо
гігієнічної оцінки нових пестицидів [188].
Мишам і щурам (самцям) водні розчини речовин (або емульсії з ДМСО) вводили у
шлунок за допомогою металевого зонду. При введенні речовин в шлунок
дотримувались техніки введення й ураховувались дані про кількість рідини, яку
допустимо вводити тваринам в залежності від шляху введення, їх виду та маси
тіла [189].Спостереження за тваринами проводилось упродовж 14 діб після
гострого отруєння. Основним критерієм оцінки гострої токсичності були дози, що
викликали загибель 50 % тварин (ЛД50). Параметри токсичності розраховували за
допомогою пробіт-аналізу кривих летальності за методом Прозоровського В.Б.
[190].
Упродовж усього експерименту відмічали клінічні ознаки інтоксикації,
враховували час загибелі тварин. Середній час загибелі тварин (ЕТ50)
розраховували за методом Красовського Г.Н. [191].
Коефіцієнт варіабельності видової чутливості (КВЧ) вираховували по відношенню
ЛД50 найменш чутливого виду тварин до ЛД50 для найбільш чутливого виду тварин
[188].
Про ступінь кумулятивної дії речовин судили за індексом кумуляції (Iкум.).
Індекс кумуляції визначали в досліді з однократним введенням речовини за
формулою Штабського Б.М. і Кагана Ю.С.:
, де
ЛД5014 – середня смертельна доза на 14 добу,
ЛД501 - середня смертельна доза на 1 добу [192].
Експерименти по вивченню гострої токсичності речовин на інфузоріях Tetrahymena
pyriformis W. проводили відповідно до Методичних рекомендацій [193]. Основними
критеріями при вивченні токсичних властивостей хімічних речовин для інфузорій
Tetrahymena pyriformis W. були ріст і чисельність популяції, швидкість руху,
форма тіла, морфологічні зміни та загибель інфузорій.
Параметри гострої токсичності речовин для Tetrahymena pyriformis W. встановлені
в 30-хвилинному експерименті. Величини летальних доз – ЛД50, ЛД16 і ЛД84,
розраховували за допомогою пробіт-аналізу кривих летальності за методом
Прозоровського В.Б. [190]. Кумулятивну дію речовин для інфузорій оцінювали за
коефіцієнтом кумуляції, отриманому в субхронічному експерименті при постійному
збільшенні дози речовини через кожні 30 хвилин упродовж 2 годин [193].
Коефіцієнт кумуляції Ккум розраховували за формулою:
, де
ЛК50(ch) – середня смертельна доза в субхронічному експерименті,
ЛК50(ac) – середня смертельна доза в гострому експерименті.
Для прогнозування токсичності
- Київ+380960830922