РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експерименти виконані на 220 статевозрілих щурах обох статей лінії Вістар масою 157-200 г віком 4-6 місяців. Розподіл тварин в групах досліджень приведений в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин в групах досліджень
Характер дослідженьКількість щурів в групісамцісамки1. Інтактні 17142. Емоційний стрес 22173. Несправжня кастрація 994. Тестектомія 95. Емоційний стрес + тестектомія 116. Тестектомія + корекція статевими гормонами 137. Емоційний стрес + тестектомія + корекція
статевими гормонами 128. Тестектомія + корекція кальцитоніном 79. Емоційний стрес + корекція кальцитоніном710. Емоційний стрес + тестектомія + корекція
кальцитоніном 811. Оваріоектомія 1212. Емоційний стрес + оваріоектомія 1313. Оваріоектомія + корекція статевими гормонами 914. Емоційний стрес + оваріоектомія + корекція
статевими гормонами 915. Оваріоектомія + корекція кальцитоніном 716. Емоційний стрес + корекція кальцитоніном717. Емоційний стрес + оваріоектомія + корекція
кальцитоніном 8 Тварин утримували на звичайному раціоні віварію в стандартних умовах. Експерименти виконані з урахуванням сезонних і добових біоритмів. Кожна серія досліджень мала відповідну контрольну групу. Попередньо проводили рандомізацію тварин за масою тіла.
При проведенні експериментальних досліджень дотримувались рекомендацій щодо медико-біологічних досліджень згідно міжнародних принципів Європейської конвенції "Про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментів та інших наукових цілях" (Страсбург, 1985) та норм біомедичної етики, відповідним Законам України "Про захист від жорстокого поводження" (Київ, 2006).
Існує багато експериментальних моделей емоційного стресу, в основі яких лежить відтворення конфліктних поведінкових ситуацій. Нами була вибрана модель емоційного стресу за Є.А. Юматовим та співавторами, в основі якої лежить відтворення природньої зоосоціальної конфліктної поведінки [110].
Щурів в кількості від 2 до 4 розміщували в звичайних клітках для тварин з просверленими отворами в дні клітки. Діаметр отворів - 10-15 мм, відстань між отворами - 100 мм. Тварин утримували без обмеження води та їжі. Щурів індивідуально фіксували за хвіст до дна клітки: хвости просовували назовні і фіксували лейкопластирем. Тварина мала практично повну рухливість: могла їсти, пити, приймати різні пози. Фіксація тварин проводилась 4 дні по 5 годин. В умовах фіксації у тварин виникала агресивна поведінка, яка характеризувалась укусами, вокалізацією, тахіпное, спалахами люті. Одні тварини проявляли домінуючу поведінку, інші - знаходились в позах підпорядкування, які зберігались протягом всього часу фіксації. Після звільнення тварин агресивна поведінка зберігалась протягом 20-40 хвилин.
На четвертий день відтворення емоційного стресу проводили евтаназію тварин під гексеналовим наркозом (50 мг/кг ваги).
Для оцінки розвитку емоційного стресу внаслідок застосування вказаної моделі були використані класичні критерії: маса наднирників, тимуса, селезінки та ульцерогенез. При розробці моделі Є.А. Юматовим та співавторами були визначені концентрації катехоламінів та глюкокортикоїдів, тому для оцінки тяжкості емоційного стресу концентрація цих гормонів нами не визначалась [110].
Недостаність гонад моделювали шляхом оваріоектомії самок та тестектомії самців за методом Я.Д. Кіршенблата під ефірним наркозом за 20 днів до початку відтворення емоційного стресу [28].
Корекцію статевими гормонами проводили введенням per os чоловічих та жіночих статевих гормонів шляхом використання препаратів: "Андріол" (10 мкг/кг) (Schering, Німеччина) та "Фемостон" (10 мкг/кг) (Solvay Pharmaceuticals, Нідерланди). Дозу препаратів розраховували, виходячи з мінімальної терапевтичної дози для тварин, а також з урахуванням вмісту відповідних гормонів у препаратах [33, 67]. Дані препарати включають аналоги статевих гормонів: тестостерону - перший препарат та комбінацію естрадіола валеріата та дідрогестерона - відповідно другий [72]. Препарати вводили напередодні та кожен день під час моделюваня емоційного стресу. Корекцію кальцитоніном проводили введенням підшкірно препарату "Міакальцик" (0,2 мкг/кг) (Novartis, Норвегія) - препарату кальцитоніна лосося, гіпокальциемічний ефект якого в десятки разів перевищує ефективність такого людини чи свині [68]. Дозу введення препарату розраховували виходячи з мінімальної терапевтичної дози та з урахуванням того, що 1 одиниця препарату (МЕ) відповідає концентрації гормону, який викликає у щурів зниження рівня кальцію в крові на 10% [68]. Препарат вводили напередодні та кожен день під час моделювання емоційного стресу.
2.1. Біохімічні методи дослідження
2.1.1. Визначення мінерального компоненту кісткової тканини. Мінеральні компоненти в кістковій тканині визначали в мінералізаті кісткової тканини. Для отримання мінералізату, кісткову тканину спочатку озолювали при температурі 450-500 0С в муфельній пічці. З отриманої золи готовили мінералізат. Для цього 10,0 мг золи поміщали в пробірку, розчиняли в 0,5 мл концентрованої соляної кислоти і кількісно переносили в мірну колбу на 250 мл, де до мітки доводили об'єм водою [35].
Визначення кальцію методом, заснованим на реакції з гліоксаль-біс- [2-оксианілом]. Принцип методу: реактив гліоксаль-біс-[2-оксианілом] утворює з іонами кальцію в лужному середовищі комплекс червоного кольору, інтенсивність якого визначається фотометрично. Концентрацію кальцію в сироватці крові та кістковій тканині визначали за допомогою тест-системи фірми "Lachema" [13].
Визначення неорганічного фосфору по відновленню фосфорномолібденової кислоти. Принцип методу: після осадження білків в центрифугаті залишається неорганічний фосфор, який взаємодіє з молібденовою кислотою та утворює фосфорномолібденову кислоту.