РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛИ
ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Дослідження виконувались з 2003 по 2007 рік у науковій лабораторії кафедри мікробіології, вірусології та епізоотології Державного вищого навчального закладу "Державний агроекологічний університет", у Центральній державній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України, а також у референтних центрах з вивчення грипу птахів VLA (Вейбрідж, Англія), Федеральній державній установі "Федеральний центр охорони здоров'я тварин" (Володимир, Росія) і Федеральній державній установі "Центральний науково-дослідний інститут епідеміології" (Москва, Росія).
Епізоотологічний моніторинг грипу птахів проводився серед різних видів птахів в різних областях України та АР Крим. У 2003-2006 роках було досліджено на грип птахів 423098 проб. Згідно з рекомендаціями МЕБ діагноз на грип птахів встановлювали комплексно з врахуванням результатів епізоотологічних, клінічних, патолого-анатомічних та лабораторних (РГА, РЗГА, ІФА та ПЛР) методів досліджень. Для досліджень на грип відбирали свіжі трупи та хвору птицю у кількості не менше п'яти голів з кожної групи, підозрілої у захворюванні [233, 234]. Для вірусологічних досліджень відбирали проби змивів з глотки та клоаки, внутрішні органи (легені, трахею, селезінку, печінку, повітроносні мішки) та головний мозок. Для проведення ретроспективної діагностики відбирали не менше 25 проб сироваток крові від однієї групи птахів.
Проби змивів доставляли до лабораторії для проведення вірусологічних (ізоляція вірусу на курячих ембріонах з наступною ідентифікацією) та молекулярно-генетичних досліджень. Для деконтамінації змивів до середовища 199, в якому їх транспортували, додавали антибіотики (4 %-й розчин гентаміцину сульфату, 1000 мкг/1 см3). Для транспортування проби (змиви, шматочки внутрішніх органів) спочатку охолоджували до +4 ?С, а потім заморожували в морозильнику до -20 ?С, після чого в термосах з сухим льодом доставляли до лабораторії. Для ізоляції та типізації вірусу грипу із відібраних проб органів та тканин ураженої птиці готували гомогенати 1:10 на 0,9 %-му розчині NaCl або фосфатному буфері (рН 7,2-7,4) з додаванням пеніциліну та стрептоміцину. Отримані гомогенати звільняли від часток тканин центрифугуванням та використовували для зараження курячих ембріонів [23].
Зразками вірусовмістимої рідини заражали 10 добових курячих ембріонів, з розрахунку не менше 5 ембріонів на одну пробу. Зараження проводили в алантоїсну порожнину. Інфіковані ембріони інкубували при +41 ?С упродовж 3-5 діб. У разі наявності вірусу в пробі, загибель наступала через 48-72 години після зараження. Ембріони, що загинули, розтинали, описували наявні ознаки пошкоджуючої дії патогена та відбирали алантоїсну рідину для подальшого дослідження в РГА. Після закінчення терміну інкубації, навіть за відсутності випадків загибелі, ембріони розтинали, відбирали алантоїсну рідину, гемаглютинуючу активність якої визначали у реакції гемаглютинації з 1 %-ю суспензією еритроцитів півня. У разі відсутності позитивної реакції в РГА додатково проводили 3?5 "сліпих" пасажів.
Для того, щоб вірусна рідина проявляла гемаглютинуючі властивості, концентрація віріонів грипу в ній має бути від 10 і більше млн/см3. При адаптації високопатогенних вірусів грипу птахів до курячих ембріонів інокулят розводили 1:2, а при культивуванні слабкопатогенних вірусів здійснювали його концентрування [271].
Постановка реакції гемаглютинації (РГА). Реакцію проводили відповідно до рекомендацій МЕБ [233, 234]. В разі виявлення антигену у титрах 1:16 і вище, результат вважали позитивним. Після виявлення збудника за допомогою реакції гемаглютинації, визначення накопичення його в курячих ембріонах та ембріонопатогенності, здійснювали ідентифікацію збудника, встановлюючи, зокрема, наявні субтипи з гемаглютиніну та нейрамінідази [36].
Постановка реакції затримки гемаглютинації (РЗГА). З метою визначення субтипу вірусу за гемаглютиніном (ГА) використовували референтні або комерційні антигемаглютинуючі моноспецифічні сироватки до кожного з 16 субтипів ГА (Н, НА). При постановці цього тесту субтип вірусу визначали за максимальним титром в реакції затримки гемаглютинації. Реакцію проводили відповідно до рекомендацій МЕБ [233, 234]. Титр антитіл 1:16 і вище рахували позитивним. Як позитивний контроль використовували сироватку крові курей, імунізованих інактивованим антигеном вірусу грипу підтипу H5N1 виробництва ФДУ "ФЦОЗТ" (Володимир, Росія).
Визначення субтипу нейрамінідази НА здійснювали у реакції пригнічення активності нейрамінідази, яка базується на зміні забарвлення субстрату у разі надходження до нього активної (незаблокованої) нейрамінідази. Для постановки реакції також використовували моноспецифічні сироватки до кожного з типів нейрамінідази вірусу грипу. Після визначення субтипу виділеного ізоляту вірусу грипу за гемаглютиніном, у разі його належності до Н5 або Н7-субтипів, характеризували ступінь його патогенності [233].
Молекулярна діагностика грипу птахів. Для діагностики грипу за методом ПЛР використовували змиви з клоаки та трахеї, гомогенати внутрішніх органів та периферійну кров, стабілізовану трилоном Б (ЕДТА). Зважаючи на нестабільність РНК, зберігання матеріалу при високих температурах (вище -
20 °С), а також багаторазове заморожування - неприпустимі.
Підготовка відібраного матеріалу для досліджень передбачала спочатку ізолювання зразку РНК з наступним напрацюванням компліментарної ДНК (кДНК), що в подальшому використовується для постановки ПЛР. Для екстракції РНК вірусу грипу застосовували так звану сорбентну екстракцію, яка передбачає руйнування білкових, клітинних і сполучнотканинних елементів за допомогою лізуючого розчину, накопичення РНК на полісахаридному сорбенті, кількаразове відмивання етиловим спиртом різних концентрацій та органічними розчинниками з наступним елююванням РНК водою або іншими елюентами. При цьому використовували комерційні н