Ви є тут

Генетична гетерогенність HBV та її вплив на імунопатогенез та перебіг HBV-інфекції

Автор: 
Тимкович Мирослава Андріївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U001282
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ І ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження

Представлена робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології з курсом інфекційних хвороб медичного факультету Ужгородського національного університету і клінічній базі - обласній інфекційній лікарні (ОІЛ) м.Ужгорода.
Результати нашої роботи базуються на обстеженні 155 хворих, а саме: 76 пацієнтів на ГГВ та 79 - на ХГВ віком від 16 до 60 років, які протягом 2002-2006 р. знаходилися на стаціонарному лікуванні в обласній інфекційній лікарні м.Ужгорода, гастроентерологічному відділенні Ужгородської центральної міської клінічної лікарні, гастроентерологічному відділенні обласної клінічної лікарні м.Ужгорода, або лікувалися амбулаторно в кабінеті інфекційних захворювань поліклініки №1 м.Ужгорода. З них жінок було 83, чоловіків - 72. Клінічне обстеження хворих включало уточненя скарг, епідеміологічного анамнезу, анамнезу захворювання, даних об'єктивного обстеження, проведення додаткових лабораторних та інструментальних методів дослідження. Порівняльну групу склали 20 практично здорових осіб - донори крові, віком від 18 до 34 років, з них 14 чоловіків та 6 жінок.
Підтвердженням діагнозу ГВ було виявлення у сироватці всіх хворих специфічних серологічних маркерів ГВ (HBsAg, анти-НВсIgM, анти-НВс IgG, у більшості хворих також визначали НВeAg та анти-НВе) методом імуноферментного аналізу (ІФА)(ELISA) з використанням тест-систем НВО "Диагностические системы" (Росія). На підставі негативних результатів індикації серологічних маркерів гепатитів А, С, D (анти-HAV IgM, анти-HCVсум, анти-НDV IgM) методом ІФА здійснювалося виключення мікст-гепатитів.
Дослідження проводилися в динаміці хвороби: при ГГВ - в періоді розпалу на висоті інтоксикаційного синдрому та перед випискою зі стаціонару, що відповідало нормалізації клініко-біохімічних показників; при ХГВ - при загостренні хвороби та клініко-лабораторній ремісії. Матеріалом для наших досліджень була сироватка крові, яку у хворих, що були під нашим спостереженням, брали з інтервалом через кожні 7 днів, але для наших досліджень відбиралися проби, які відповідали періодам піку розпалу та початку реконвалесценції ГГВ; при хронічному ГВ - відповідно, при загостренні хвороби та клініко-лабораторній ремісії. Натще,у спеціальну стерильну пробірку із антикоагулянтом (розчин гепарину 0,1 мл) кількістю 10 мл із ліктьової вени брали кров для дослідження. Сироватку відбирали після інкубації та центрифугування отриманої крові, яку далі розливали у пробірки типу "Епендорф" по 1,5 мл. Зберігали зразки при -60°С. Одноразове розмороження сироватки допускалося тільки безпосередньо перед постановкою досліджень.
Генодіагностичні дослідження включали визначення реплікативної активності HBV на підставі якісного виявлення в сироватці крові ДНК HBV методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (набір реагентів "Полігеп В" фірми "Літех", Москва, Росія) за допомогою праймерів, комплементарних консервативній ділянці S-гену. Аналіз поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів з уточненням генетичної структури вірусу проводили за методом M. Mizokami із співавт. [193] у модифікації ЦНДІЕ м.Москви (Росія). Методом аналізу поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів після ампліфікації ділянок генома довжиною 470 пар основ, який кодує поверхневий антиген, проводилося генотипування вірусу ГВ. В процесі генотипування продукти ПЛР оброблялися генотипоспецифічними ендонуклеазами рестрикції. Приготування реакційної суміші проводилося на 15 реакцій: у пробірку 0,5 мл вносили 3О мкл ендонуклеазного буферу, 3О мкл BSA (концентрація 1 мкг/мл) і додавали 15 мкл ферменту (концентрація 5 од/мкл). Перемішували на вортексі, розкапували у мікропробірки по 5 мкл реакційної суміші. У кожну пробірку з реакційною сумішшю додавали певну кількість ампліфіконів (специфічних фрагментів ДНК вірусу ГВ).
Для оцінки імунологічного реагування організму на НВV-інфекцію проводилося визначення сироваткових концентрацій цитокінів: IJI-l?, ???-?, ІЛ-6, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10 за допомогою тест-систем ООО "Протеиновый контур" (Санкт-Петербург, Росія), користуючись інструкцією виробника з використанням твердофазного імуноферментного методу із застосуванням пероксидази хрону як індикаторного ферменту.
Інші лабораторні показники у динаміці ГГВ та ХГВ визначалися за загальноприйнятими методиками: вміст білірубіну і його фракцій методом L.Jendrassik, P.Grof [73], активність АлАТ - уніфікованим методом S.Reitman, S.Frankel [205], тимолову пробу - методом J.Huerga, H.Popper, сулемову пробу - методом F.Grinstedt [73], рівень загального білка - мікробіуретовим методом G.Kingsley [178], білкові фракції - турбодиметричним методом H.Popper [73]. Біохімічні показники виражалися у Міжнародній системі одиниць СІ, яка затверджена у 1978 р. Стандартом РЕВ 1852-78 "Метрологія. Одиниці фізичних величин" і загальноприйняті значення біохімічних показників використовували як норму.
В динаміці ГГВ та ХГВ всім хворим проводилося ультразвукове дослідження органів черевної порожнини за допомогою ультразвукового сканера Ultima Pro-30 виробництва "Радмір" (м.Харків, Україна) з використанням датчиків частотою 3,5 - 6 МГц за стандартною методикою. При оцінці ультразвукової картини ГВ використовувались діагностичні критерії (Sanders, 1991), що включали: розміри печінки, однорідність структури, розміри портальної і селезінкової вен, стан жовчовивідних шляхів, селезінки.
Імунологічні показники досліджувалися також у 20 здорових осіб контрольної групи, віком від 18 до 35 років, з них 14 чоловіків та 6 жінок, в анамнезі яких були відсутні супутні і хронічні захворювання. Отримані результати рівнів досліджуваних цитокінів обстежених здорових осіб наведені у табл. 2.1. Отримані результати досліджень статистично оброблені з використанням методів варіаційної статистики. Статистична обробка даних здійснювалася за допомогою програм "Exsel-2000" та "STATISTIKA for Windows" (Statsoft Inc, США) на комп'ютері із процесо