РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Методи дослідження
Діагноз ПВДПК верифіковували за допомогою загально-клінічних тестів, ендоскопії верхніх відділів травного каналу з одночасним взяттям біопсійного матеріалу для ідентифікації хелікобактеріозу і встановлення ступеня тяжкості та активності хронічного гастриту, згідно з Сіднейською класифікацією гастритів. Ендоскопічне обстеження ДПК проводилось за допомогою фіброгастроскопів - "Олімпус - Q20" та "Пентакс - FG29W" (Японія), за розрахунком показань й протипоказань [34]. Ендоскопічний метод вважали ведучим й найбільш інформативним при постановці діагнозу ПВ, а також для оцінки слизистого бар'єру. Обов'язковим було проведення контрольного ендоскопічного обстеження для оцінки ефективності проводимої терапії.
При ФГДС у всіх хворих, за їх згодою, проводилась прицільна біопсія СО з наступним гістоморфологічним, гістохімічним та ультрамікроскопічним дослідженням отриманих біоптатів, а також для виявлення хеликобактерної контамінації СО. Гістологічне дослідження дозволяло визначити морфофункціональний стан СО шлунку та ДПК. Для цього при ФГДС після візуального обстеження методою щипку забиралися 1-4 гастробіоптату СО приватнику шлунку та в області виразкового дефекту СО ДПК, з фіксацією отриманого матеріалу в 10% розчині нейтрального формалину (по Лілі) із заливкою в парафін. Отримані гістологічні зрізи матеріалу товщиною 5-7 мкм фарбувалися гематоксиліном та еозином, пікрофуксином по Ван Гізону. За для іденфікування та кількісної оцінки НР було використовано гістологічний метод дослідження шляхом посиленої окраски біоптатів за Романовским-Гимзою. При цьому методі НР фарбується в темно-синій колір і гарно виділяється як на всій поверхні СО, так і в глибині та визначається паличковидними та V-образними формами ("типа чайки"). В отриманих гістологічних препаратах визначали три ступеню контамінації НР, означаємі кількістю плюсів (+) при звеличенні мікроскопу х630: слабка (+) до 20 мікроорганізмів в полі зору, середня (++) до 50, висока (+++) більш 50 [13,34]. Кількісна морфометрична характеристика СО оцінювалася за допомогою комп'ютерного цітоанализатору "Olympus" (Японія), окуляру мікрометру АМ9-2, окулярній лінійці та сітки Автандилова Г.Г. (1991), що дозволило визначити кількісні зміни (товщини) СО, атрофічні зміни, ступень контамінації НР та стан тонусу мікроціркуляторного руслу. Оцінку ступеню активності (слабкий - І ступінь, помірний - ІІ ступінь, значний - ІІІ ступінь) та інтенсивності запалення СО, атрофічних змін, дисплазії проводили згідно патоморфологіних критеріїв [13, 34].
Кислотоутворююча й кислотонейтрализуюча функції шлунка вивчались за допомогою внутрішлункової рН-метрії - "ИкЖ-2, 53.01." (Україна), яку проводили в ранкові години (8.00-10.00), коли пацієнт перебуває у стані натще (через 12-14 годин після попереднього прийому їжі). З метою об'єктивізації базального рівня рН за 24 години перед дослідженням хворі не приймали лікувальних засобів з антисекреторною дією (блокаторів Н2-гістамінорецепторів, М-холінолітиків, міотропних спазмолітинів, антацидів), а за 3-4 години до дослідження - виключалось паління та пиття рідини.
Діагноз СПК виставляли за наявністю симптомів, згідно Римських критеріїв ІІІ, а для диференційованої діагностики застосовували іррігоскопію товстого кишечнику. Хворим на ПВДПК, у поєднанні з СПК, з метою виявлення порушень мікробіоценозу кишечнику досліджували бактеріальний склад калових мас за методою Chier, в модифікації Харченко Н.В. [55]. Для виключення супутньої патології проводили обстеження органів черевної порожнини за допомогою сучасного ультразвукового ехоскопу "SDR-1200" компанії "Філліпс", Японія.
Визначення показників клітинного імунітету проводилося методом непрямої імунофлюоресценції після їх специфічного з'єднання з моноклональними антитілами (МКАТ) до поверхневих диференціювальних антигенів (кластерів диференціації) та підрахунку на клітинному сортері. В роботі використовували сертифіковані в Україні комерційні МКАТ класів CD3+, CD4+, CD8+, CD22+ НВЦ "МедБиоСпектр" (РФ - Москва). При цьому MКAТ класу CD3+ вважали відносними до тотальної популяції Т-лімфоцитів, CD4+ - до популяції Т-хелперів/індукторів, CD8+ - Т-супресорів/ кілерів, CD22+ - до В-клітин. Вираховували імунорегуляторний індекс CD4/CD8, який трактували як співвідношення лімфоцитів з хелперною та супресорною активністю [76]. Функціональну активность Т-лімфоцитів за допомогою реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) при її постановці мікрометодом з використанням в якості неспецифічного мітогену фітогемаглютиніну (ФГА) [97]. Рівень ЦК крові (IL1?, IL2, IL4 та ФНП?) визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). Визначення рівня цитокінів проводилося за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). Рівень прозапальних (ІL-1?, ІL-2, ФНП?) та протизапальних (ІL-4) цитокінів визначали за допомогою сертифікованих в Україні реагентів виробництва ТОВ "Протеиновый контур" - ProCon (РФ - СПб): Pro Con IL-1?, ProCon TNF?, ProCon IL-2 та ProCon IL-4. Дослідження проводилися згідно до інструкції фірми-виробника. В якості норм імунологічних показників було використано дані міжкафедральної імунологічної лабораторії Луганського державного медичного університету отримані при обстеженні 130 здорових донорів молодого віку, які постійно мешкають в Луганській області.
Статистична обробка отриманих результатів клініко-експериментальних досліджень проаналізована з використанням методів варіаційної статистики, яка була проведена на персональному комп'ютері ІВМ з використанням стандартних пакетів програм Microsoft "Excel - 5". Достовірність різниці при порівнянні середньоарифметичних величин визначали за допомогою критерію Стьюдента - t, різницю вважали достовірною при р<0,05, а при порівнянні частоти ознак - методом альтернативного варіювання. Також визначали середню величину (М) та її помилку (m). З метою визначення зв'язку між двома показниками в межах однієї вибірки застосований коефіцієнт парн
- Київ+380960830922