Особливості геномної мінливості кукурудзи в культурі in vitro

<p>РОЗДІЛ 2.<br />МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ<br />2.1. Об'єкти дослідження<br /> В роботі були використані інтактні рослини і отримані від них калюсні тканини наступних інбредних ліній кукурудзи:<br /> а) Black Mexican Sweet Corn C456 (у подальшому - С456) - насіння отримане з колекції Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (м. Київ) і з Maize Genetics Cooperative Stock Center (США, м. Урбана);<br /> б) Р346 (Pioneer 346) та отримані з неї УКЧ-5, УКЧ-6, УКЧ-7, УКЧ-8, УКЧ-9 - насіння люб'язно надані Національним центром генетичних ресурсів рослин України (НЦГРРУ) при Інституті рослинництва ім. В.Я. Юр'єва (м. Харків). Дані лінії зареєстровані в НЦГРРУ під номерами: UB0102873, UB0103498, UB0103499, UB0103500, UB0103501, UB0103359 відповідно;<br /> в) ВІР-27 і отримана з неї ЧК-218 - люб'язно надані з колекцій Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (м. Київ) та Селекційно-генетичного інституту УААН (м. Одеса).<br /> <br />2.2. Індукція калюсоутворення і умови вирощування культури тканин<br /> <br /> <br /> а) отримання калюсів із незрілих зародків. Відокремлені від рослин початки (чотирнадцять діб після контрольованого примусового самозапилення) розрізали на декілька частин і стерилізували 30 хв. у 10% розчині комерційного відбілювача "Білизна". Після цього тричі ретельно промивали стерильною водою і 30 сек витримували у 70% етиловому спирті з наступним трикратним промиванням стерильною водою. Далі сегменти початків пінцетом переносили в скляну чашку Петрі і з насінин скальпелем вичленовували зародки. Зародки переносили на стерильне агаризоване живильне середовище в кількості 3-4 шт на одну пробірку на відстані 5-10 мм один від одного. Для індукції калюсоутворення використовували агаризоване живильне середовище з половинним вмістом мінеральних солей за Мурасіге і Скугом (МС) [168] (табл. 1.2). Як експланти були використані 14-денні незрілі зародки розміром 1-1,5 мм. Зародки відбирали з найкраще сформованих зернівок центральної частини початку (від 10 до 30 зародків з одного початка).<br /> б) отримання калюсів із проростків кукурудзи. Зріле насіння кукурудзи стерилізували 70% етиловим спиртом протягом 2 хв, потім 20% розчином "Domestos" протягом 20 хв, промивали 6 разів стерильною дистильованою водою і пророщували на агаризованому середовищі з половинним вмістом солей за МС у темряві при температурі 24°С. Калюси отримували окремо з тканин кожного індивідуального проростка. Як експланти використовували апікальну частину 1-2-денних проростків довжиною 2-5 мм. Індукцію калюсогенезу здійснювали на модифікованому середовищі МС, склад якого наведено в табл. 1.1. Отримані культури тканин вирощували на тому ж середовищі, яке було використане для отримання первинного калюсу.<br /> в) отримання калюсів із повітряних коренів кукурудзи. Як експланти використовували повітряні корінці на 14-й день після проростання. Рослини кукурудзи пророщували в стерильних умовах на середовищі Мурасіге і Скуга з половинним вмістом солей. Повітряні корені подрібнювали на відрізки 5-10 мм і поміщали для індукції калюсогенезу на живильне середовище, склад якого наведено в табл. 1.1.<br />2.3. Культивування калюсних тканин кукурудзи in vitro<br /> <br /> <br /> Індукцію калюсоутворення в умовах in vitro та подальше вирощування отриманих культур тканин проводили на модифікованому живильному середовищі МС. Склад середовища наведено в табл. 2.1. рH середовища до стерилізації доводили до значення 5,5-5,7, потім розливали в скляні пробірки по 15 мл в кожну, закривали фольгою і стерилізували автоклавуванням протягом 15 хв при тиску в 1 атмосферу. <br /> Культури вирощували при 24C в темряві у спеціальному термостатованому приміщенні у стерильних умовах. Через кожні 30 діб культивування тканини пересаджували на свіже середовище, приготовлене заздалегідь (мінімум за тиждень). <br /> Таблиця 2.1 <br /> <br />Склад живильного середовища для вирощування <br />калюсних тканин кукурудзи<br />Компоненти середовищаКонцентрація, мг/л12NH4NO31650KNO31900CaCl2·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO417012H3BO36,2MnSO4·4H2O22,3 Продовження табл. 2.1<br />12CoCl2·6H2O0,025CuSO4·5H2O0,025ZnSO4·7H2O8,6Na2MoO4·2H2O0,25KJ0,83FeSO4·7H2O27,8Na2EДTA·2H2O37,3Тіамін0,25Піридоксин0,25Нікотинова кислота1,25Мезоінозит100Гліцин7,72,4-Д2,0Пантотенат кальцію0,25Аспарагін1000Д-маніт30000Сахароза30000Агар-агар8000 <br />2.4. Виділення ДНК з інтактних рослин і калюсних тканин <br /> <br /> <br /> ДНК з калюсних тканин кукурудзи виділяли цетавлоновим методом Роджерса і Бендіха [216]. Тканини, заморожені в рідкому азоті, розтирали в порошок. ДНК екстрагували рівним об'ємом 2?СТАВ буферу (0,1 М трис-HCl, рН 8,0; 40 мМ ЕДТА, рН 8,0; 1,4 М NaCl, 2% цетавлон, <br />1% -меркаптоетанол). Надто густий гомогенат розводили додаванням 1?СТАВ буферу. Екстракцію проводили протягом 30 хв при 65C. Грубий екстракт очищали рівним об'ємом суміші хлороформ/ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1 (ХІС) перемішуючи 5 хв після утворення гомогенної суспензії. Органічну і неорганічну фази розділяли центрифугуванням при 3000 об/хв, 15 хв. До водної фази додавали 1/10 об'єму суміші 10% цетавлону (цетилтриметиламоніумбромід) і 0,7 М NaCl, і екстрагували ХІС. Розчин ДНК від органічної фази відділяли центрифугуванням. Очистку ХІС з додаванням до водної фази 1/10 об'єму 10% цетавлону з 0,7 М NaCl повторювали до повного зникнення інтерфази. НК з водної фази осаджували рівним об'ємом буферу, наступного складу: 1% цетавлону, 50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЕДТА (рН 8,0) і витримували 10 год при кімнатній температурі. Осад НК збирали центрифугуванням при 3000-5000 об/хв впродовж 10 хв і розчиняли в невеликому об'ємі (1-2 мл) 50 мМ трис-HCl (рН 8,0); 20 мМ ЕДТА (рН 8,0); 0,7 М NaCl буферного розчину. Знову проводили очистку ХІС, щоб позбутися залишків цетавлону і NaCl.<br /> Нуклеїнові кислоти з розчину осаджували двома об'ємами 96% етанолу протягом 10 год при -20C і центрифугуванням 15 хв при 3000 об/хв. Осад двічі промивали 70% етанолом і розчиняли в 0,</p>