Ви є тут

Експресія мРНК ванілоїдних рецепторів у культурі нейронів гіпокампа

Автор: 
Дребот Юлія Іванівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U002418
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследований
2.1. Объект исследования
Поскольку мозг млекопитающих организован чрезвычайно сложно, для изучения некоторых фундаментальных механизмов, лежащих в основе его функций, используют простые модельные системы. Культуры различных отделов центральной нервной системы являются удобными экспериментальными моделями и позволяют проводить прямые манипуляции непосредственно с отдельными нейронами млекопитающих. Показано, что развитие клеток, как в культуре, так и в живом организме во многом определяется их генетическим аппаратом. В частности, свойства клеток центральной нервной системы, развивающихся в культуре, обеспечивают формирование специализированных генетически детерминированных синаптических контактов между нервными клетками. В наших исследованиях мы использовали культуру нейронов гиппокампа новорожденных крыс, как удобный объект для дальнейших экспериментов.
2.1.1. Покрытие стёкол поли-L-лизином и ламинином.
Стёкла обрабатывались в течение 24 часа в спирте (96%) и эфире (1:1), затем промывались дистиллированной водой 6 раз и стерилизовались в жарочном шкафу при 180?С в течение 2 часов. Стёкла помещали в стерильные чашки Петри диаметром 35 мм, и на каждое стекло помещалась капля 0,1% раствора поли-L-лизина и ламинина, объёмом 0,5 мл, растворённого в 150 мМ боратном буфере (рН=8,35). Стёкла инкубировались в поли-L-лизине и ламинине в течение 0,5 часа при комнатной температуре. После этого каждая чашка промывалась в дистиллированной воде, 3 раза по 2 мл. Покрытые чашки хранились в холодильнике при 2-5?С в течение 2-3 месяцев.
2.1.2. Культивирование нейронов гиппокампа
Эксперименты проводились in vitro на культивируемых нейронах гиппокампа, возраст культуры от 14 до 25 дней. Для получения культуры нейронов гиппокампа мы использовали новорожденных крыс линии Вистар. Для получения суспензии нервных клеток мы использовали комбинацию из двух методов: ферментативная обработка (использовался трипсин) и механическая диссоциация. Для длительного культивирования нервных клеток мы использовали питательную среду МЕМ (Gibco №42360-024, +Earles,+Glutamax1,+25mM Hepes) с добавлением сыворотки(Gibco №26050-088) 10% 5 мл, инсулин 1, 25% in 0,01NHCl 24?L, гентамицин (Gibco№15710-049) 10мг/мл 805?L, рН = 7.2-7.4
Животных декапитировали, и после выделения гиппокампа кусочки мозга переносились в раствор трипсина где гиппокамп подвергался ферментативной обработке 0,25% раствором трипсина (Sigma T4799) при 37?С в течение 7-10 минут. Все это проводилось в инкубаторе ("Jouan", Франция), содержащий воздушно-газовую среду, обогащенную СО2 (5%), и поддерживающий температурный режим 37? С. Для ингибирования фермента после ферментативной обработки гиппокамп помещали в холодную (+2..8?С) среду, состав которой описан выше, и отмывали в течение 3-5 мин. по два раза в 0,5 мл среды. Суспензию клеток гиппокампа получали с помощью диссоциации оплавленными стеклянными пипетками постепенно уменьшающихся диаметров. Пипетки изготавливались на специальной микрокузнице, путем обрезания стеклянного кончика микропипетки платино-иридиевой спиралью. Спираль нагревалась до высокой температуры путем пропускания через нее электрического тока и в момент касания со стеклом пропускание тока прекращалось что приводило к остыванию спирали и образования ровного четкого скола нужного диаметра на краю аппилицирующей пипетки.
Клетки помещали на предварительно покрытые поли-L-лизином и ламинином (Sigma, США) стекла диаметром 12-22 мм, которые помещали в чашки Петри диаметром 35 мм. Через 2 часа в каждую чашку добавляли по 1 мл культуральной среды (состав которой описан выше).
На третий-четвертый день культивирования в среду добавляли 10 мкл цитозин-A-D-арабино-фуранозида ("Sigma", США) для ингибирования пролиферации глиальных клеток. Смена питательной среды проводилась через 20-24 ч.
2.2.Электрофизиологические методы.
Внеклеточный базовый раствор при исследовании сТПСТ, содержал в себе в mM: NaCl 140; KCl 2; CaCl2 2; MgCl2 1; HEPES 10; глюкоза 10; pH 7.3; осмотичность 300 mOsm. Во внеклеточный раствор добавлялись блокаторы NMDA (50?M of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) и AMPA-каинатных рецепторов (20?M of D-2-amino-5-phosphonopentanoic acid (DL-AP5)). Внутриклеточный раствор для пэтч-пипетки во всех случаях содержал в себе в mM: KCl 140; NaCl 5; CaCl2 0.1; EGTA 1; MgATP 2; GTP 0.3; HEPES 10; pH 7.3; осмотичность 290mOsm. Стеклянные пипетки изготавливаись из легкоплавких боросиликатных стеклянных капилляров диаметром 1,5-1.6 мм. Изготовление пипеток проводилось с помощью микрокузницы , в две стадии. Наружный диаметр кончика пипетки составлял 2-3 мкм а сопротивление пэтч-пипеток - 2-5 Мом. Для более удобного заполнения пипеток раствором были использованы заготовки имеющие внутри тонкие стеклянные филаменты
Все эксперименты проводились при комнатной температуре 18-22С.
2.3. Генетические методы исследований.
2.3.1.Выделение РНК, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция.
Для определения генов, что кодируют различные формы катионных каналов с подсемейства TRPV, которые экспрессируются в культуре нейронов гиппокампа, был использован метод обратной транскрипции (ОТ) с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЛР). РНК выделяли с ткани гиппокампа новорожденных крыс с использованием набора Trizol RNA-prep (Isogen, Россия). Обратную транскрипцию проводили с использованием First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва), применяя 2-2.5 мкг общей РНК и олигомерный (dT)18 праймер.
Полученная вследствии ОТ кодируемой ДНК (кДНК) поддавалась генспецифической обработке ПЦР- амплификации с использованием следующих пар праймеров: прямой (sense) - 5`-GCGAGTTCAAAGACCCAGAG-3` и обратный (antisense) - 5`-GGCATTGACAAACTGCTTCA-3`(для оценки экспрессии TRPV1), - прямой (sense) 5`-TGCATACACAGAAGGCTCCA-3` ` и обратный (antisense) -5`- CCGGAATCCTTGTCAATCTG-3`(для оценки экспрессии TRPV2), прямой (sense) - 5`- CGT