РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Дослідження проведені на самках статевозрілих мишей СВА віком 6-8 тижнів масою (16-20 г), що утримувалися на стандартному раціоні віварію. Для дослідів використовували самок на стадії діеструсу, яку оцінювали за допомогою вагінальних мазків [38]. При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин.
Забір яєчників мишей здійснювали в проміжку часу від 10.00 до 10.30.
2.2. Виділення оваріальних фолікулів та ооцитів
Тварин присипляли ефіром і забивали методом зміщування шийних хребців. Фолікули механічно звільняли від сполучної тканини під мікроскопом МБС-9. Після проколу фолікула голкою в середовищі DME виділяли ооцити, оточені кумулюсом (кумулюсно-ооцитарні клітинні комплекси - КОКК) та ооцити без кумулюсу. Від фолікулярних клітин КОКК відділяли не вдаючись до ферментів - механічно. Гранулярні клітини ідентифікували за морфологічними ознаками під мікроскопом. Загальне число КОКК, які виділяли з обох яєчників однієї миші, становило 25-30 шт. Ооцити і кумулюсні клітини отримували з КОКК, які пропускали через тонку скляну піпетку. Ооцити знаходилися на стадії "зародкового пухирця" (ЗП+), яку встановлювали за наявністю чітко сформованої ядерної оболонки [38].
2.3. Культивування та підраховування ооцитів
КОКК та ооцити культивували в камерах, що містили 500 мкл культурального середовища DME з 15 ммоль HEPES з фізіологічною концентрацією Са2+ (1,71 ммоль/л), в термостаті при 37 °С у стерильному боксі. Усі контрольні та тестовані ооцити і КОКК культивувалися в однакових умовах.
Час контролю за проходженням ооцитами мейотичних стадій нами було обрано виходячи з того, що для спонтанного розчинення ЗП ооцитам гризунів (миші, щури, хом'яки) необхідно 2-4 год після звільнення від фолікула, а для формування першого ПТ 16-20 год [91] .
Підраховування ооцитів здійснювали в кінці терміну культивування, а кількість ооцитів із ЗП+ або розчиненим ЗП (ЗП-) і таких, що сформували перше ПТ визначали, використовуючи мікроскоп МБС-9. Вираховували відношення кількості ооцитів з (ЗП-) та ооцитів з ПТ до початкової (загальної) кількості (ЗП+) ооцитів у відсотках (% ЗП- та % ПТ).
2.4. Приготування антиоваріальних антитіл (г-АОЦС)
АОЦС одержували шляхом імунізації кроликів антигеном (водно-сольовими екстрактами тканин яєчника білих безпородних мишей) в зростаючих дозах [54]. Яєчники, виділені за стерильних умов, подрібнювали і гомогенізували у скляному гомогенізаторі разом із фізіологічним розчином (0,89 %) NaCl. Після центрифугування в надосадовій рідині визначали концентрацію білка за методом Лоурі-Фоліна [131]. Кролів імунізували за схемою (табл. 2.1).
Для імунізації використовували повний адьювант Фрейнда (ПАФ) (Serva). Внутрішньовенному введенню антигену після перших трьох імунізацій передувала ін'єкція 0,1 мл 1% розчину димедролу для профілактики анафілактичного шоку. Екстракт розводили в 20 мл фізіологічного розчину і повільно, на протязі 5 хв вводили у вушну вену. Через 5 діб після останньої імунізації визначали титр антитіл за допомогою реакції зв'язування комплементу. При титрі не менше 1:320 у тварини, через 7 діб після останнього введення антигену, в стерильних умовах забирали кров в кількості 50 мл і поміщали в термостат на 30 хв при +37 °С. Після цього кров з відділеною сироваткою переносили в холодильник і зберігали при +4 °С.
Таблиця 2.1
Схема імунізації кролів
Введення антигену Спосіб
імунізаціїкількість білкаПАФ Інтервал введення 1в подуш. лап20 мг1 мл 30 днів2.в/в п/ш5 мг
2 мг0,5 мл 7 днів3в/в п/ш7 мг
5 мг0, 5 мл 7 днів4в/в в/о10 мг
7 мг7 днів5в/в в/о15 мг
10 мг7 дніввідбір крові7 днів
Титр антитіл в цитотоксичних сироватках визначали за реакцією зв'язування комплементу. Отримано чотири АОЦС. Титр сироватки, одержаної шляхом їх змішування становив 1:320.
Виділення імуноглобулінів із сироватки крові здійснювали при допомозі сульфату амонію [29]. До 50 мл сироватки додавали 25 мл насиченого розчину сульфату амонію. Після центрифугування осад розчиняли в 50 мл фосфатного буферного розчину (рН 7,4) і знову осаджували сульфатом амонію. Таку операцію проводили тричі до утворення прозорої надосадної рідини. Після цього розчинені імуноглобуліни діалізували проти фосфатного буфера 24 год при +4 °С з 5-кратною зміною діалізного розчину і очищали на хроматографічній колонці з сефадексом G-50. Для зберігання препарат консервували азидом натрію (0,02 %). Безпосередньо перед використанням розчин імуноглобулінів діалізували проти фосфатного буферного розчину. АОАТ (г-АОЦС - сумарна гама-глобулінова фракція), отримані з АОЦС шляхом висолювання [29], мали кінцеву концентрацією білка 7,2 мг/мл [131] .
Для дослідження впливу на ооцитогенез in vivo г-АОЦС вводили внутрішньовенне мишам на стадії діеструсу. Для дослідження впливу на мейотичне дозрівання ооцитів in vitro г-АОЦС додавали у середовище культивування.
2.5. Метод оцінки апоптотичної і некротичної загибелі фолікулярних клітин
Оцінку апоптотичної і некротичної загибелі фолікулярних клітин здійснювали за зміною морфологічних ознак за допомогою методу прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот Хехст 33342 та пропідіум йодид [180]. Використаний нами метод прижиттєвого подвійного забарвлення дає можливість визначити кількість живих, апоптотичних і некротичних клітин. Пропідіум йодид проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір. Барвник Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин в зелено-синій колір. Зв'язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні риси ядерного матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад клітин на апоптотичні тільця. Забарвлення кліти