РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Відбір матеріалу та підготування його для досліджень
Усього проведено чотири серії досліджень - на мікробних популяціях рубця жуйних тварин, сліпої кишки свиней і кролів та на клітинах чистих штамів бактерій.
Метою першої серії досліджень було вивчити метаболізм рубцевих мікробних популяцій, сформованих на біосубстратах із різною доступністю за дії пентахлорфенолу (ПХФ) та природного сорбенту - кліноптилоліту (Кл). Для анаеробного культивування мікроорганізмів рубця використовували загальноприйняті методи, які описані у багатьох роботах [9, 15, 27, 30, 31, 34, 35, 39, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 52, 59-63, 65-85, 149, 180, 183, 199, 201, 209, 238, 244, 245]. Досліджували вміст рубця бичків чорно-рябої породи живою масою тіла 400-450 кг, яких поділили на дві групи (n=5). Бичкам 1-ї групи впродовж 30 днів у добовий раціон вводили більше клітковини (5-6 кг злаково-бобового сіна) на тлі порівняно невеликої кількості доступніших поживних речовин (2-2,5 кг зернових концентратів). Раціон для тварин 2-ї групи, навпаки, збагачували доступнішими поживними речовинами (4-5 кг зернових концентратів на добу), і вдвічі зменшували в ньому вміст кормів, багатих на клітковину (2,5- 3 кг злаково-бобового сіна). Інші компоненти добових раціонів для двох груп бичків були однаковими (силос кукурудзяний у довільній кількості й 10 кг кормового буряка). Середньодобовий приріст тварин складав 800-1100 г.
Рубцеву рідину, відібрану з рубця носостравохідним зондом через 2-3 год після ранкової годівлі, фільтрували із застосуванням нейлонової тканини. Фільтрат змішували з буфером McDougall (1:2), який, окрім необхідних поживних речовин, містив вітаміни й мікроелементи. Виділені мікробні популяції інкубували при 39 °С в атмосфері СО2 протягом 12-24 год [209]. Токсичність дії ПХФ на мікроби рубця оцінювали в умовах in vitro за різних умов інкубації мікроорганізмів: 1 - контроль (ростове середовище зі змішаною рубцевою мікробною популяцією без додавання ПХФ); 2-7 - в інкубаційне середовище додавали 10, 20, 40, 100, 150 і 300 мкМ ПХФ відповідно. На початку експерименту і через 2, 4, 6, 8, 10 та 12 год інкубації бактерій відбирали проби для біохімічних досліджень. У культуральному середовищі за допомогою платинових електродів визначали динаміку рівнів рН, редокс-потенціалу (Eh) [35, 51]; приріст мікробної і білкової маси та інші біохімічні показники, які будуть описані у підрозділі 2.2.
Для оцінки протекторної здатності Кл у культуральному середовищі з ПХФ [47, 74] дослідження проводили в умовах in vivo та in vitro на зразках змішаних мікробних популяцій, сформованих на більш доступних поживних біосубстратах (добовий раціон п'яти бичків - 4-5 кг зерноконцентратів та 2,5-3 кг сіна; 1-ша група) і менш доступних поживних речовинах (5-6 кг злаково-бобового сіна та 2-2,5 кг зерноконцентратів; 2-га група). Інші компоненти раціонів для обох груп тварин були однаковими (силос кукурудзяний у достатній кількості й кормові буряки по 10 кг/гол на добу). Середньодобовий приріст тварин коливався в межах 800-1100 г.
Рубцеву рідину також відбирали носостравохідним зондом через 2-3 год після ранкової годівлі й фільтрували із застосуванням нейлонової тканини. Фільтрат змішували з буфером McDougall (1:2) та інкубували при 39 °С в атмосфері СО2 протягом 12-24 год [209]. Для оцінки токсичної дії біоциду ПХФ та виявлення рівня протекторної здатності кліноптилоліту Сокирницького родовища було проведено три варіанти досліджень в умовах in vitro: 1 - контрольний (К), ростове середовище зі змішаною мікробною популяцією (К) без додавання ПХФ і Кл; 2 - ростове середовище (К) з додаванням ПХФ (40 мкМ) і 3 - ростове середовище (К) з додаванням ПХФ (40 мкМ) і Кл (3 г/пробу) [47, 76]. У процесі інкубації відбирали проби для біохімічних аналізів, які проводили зальноприйнятими методами [51, 209].
Дослідження, метою яких було виявити активність внутрішньоклітинних ензимів рубцевого бактеріального комплексу, сформованого на більш доступних поживних біосубстратах, за дії пентахлорфенолу та кліноптилоліту проведено в умовах in vivo та in vitro на зразках змішаних бактеріальних популяцій, сформованих на більш доступних поживних біосубстратах (добовий раціон п'яти відгодованих бичків ? 4-5 кг зерноконцентратів, 2,5-3 кг сіна, силос кукурудзяний у довільній кількості й 10 кг кормового буряка).
Рубцеву рідину відбирали носостравохідним зондом через 2-3 год після ранкової годівлі й фільтрували із застосуванням нейлонової тканини. [75]. Фільтрат змішували з буфером McDougall (1:2) й інкубували при 39 ?С в атмосфері СО2 протягом 12 год [209]. Для оцінки токсичної дії біоциду ПХФ та виявлення рівня протекторної здатності кліноптилоліту Сокирницького родовища було проведено три варіанти досліджень в умовах in vitro: 1 - контрольний (К), ростове середовище зі змішаною мікробною популяцією без додавання ПХФ та Кл; 2 - ростове середовище з додаванням ПХФ (40 мкМ) і 3 - ростове середовище з додаванням ПХФ (40 мкМ) та Кл (3 г/пробу) [51, 59, 75]. Мікробні культури росли до середини експоненціальної фази (log-фази). Клітини збирали шляхом диференційного центрифугування. Бактеріальну фракцію одержували при 5000 об./хв, 30 хв, 4 ?С. Потім двічі промивали 20 мМ К-Na-фосфатним буфером (рН ? 7,5), доводили концентрацію до 1 мг/мл і заморожували, додаючи до суспензії пісок (на одну третину об'єму). Руйнували клітини на холоді (4 ?С) з використанням планетарного вібратора К-23 (ФРН) при 1000 об/хв протягом 6 хв або ультразвукового диспергатора УЗДН-1 (22 кГц упродовж 15 хв з інтервалом 30 с при 0 ?С). При цій же температурі шляхом центрифугування (18 000 об./хв, 30 хв) одержували цитозолеву фракцію бактеріальних клітин. В останній визначали вміст білка [15, 30] і спектрофотометрично - активність ензимів: лактатдегідрогенази - ЛДГ (КФ 1.1.1.27), форміатдегідрогенази - ФДГ (КФ 1.2.1.2), малатдегідрогенази - МДГ (КФ 1.1
- Київ+380960830922