Ви є тут

Вплив N-стеароїлетаноламіну на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин

Автор: 
Хмель Тетяна Олексіївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U002526
129 грн
Додати в кошик

Вміст

Розділ 2
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
2.1. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1.1. Експериментальна модель in vivo (карцинома Льюїс)
Карцинома легень Льюїс (3LL) була виявлена у мишей лінії C57 Bl/6 в 1951 році.
Метастазує гематогенно в легені практично в 100 % випадків. Пухлину
перещеплювали внутрішньом’язево в праву задню лапку миші (1,2 млн. клітин
карциноми в 0,1 мл середовища 199). Відомо, що в процесі розвитку карциноми
змінюється її дисемінаційна активність. За літературними даними визначено два
піки дисемінації: на 10 добу та на 21 добу [[cxliv]].
Проведені експерименти направлені на вивчення впливу різних доз NSE на ріст і
метастазування карциноми Льюїс за умов введення N-стеароїлетноламіну на різних
стадіях пухлинного росту (на початку розвитку пухлини і на стадіі вже
сформованої неоплазми). Досліди виконували на мишах-самцях лінії С57Bl/6 вагою
20-23г. Тварини утримувались на звичайному раціоні харчування. Перед початком
експерименту мишей поділили на групи: І –„Інтактні тварини”, ІІ –„Пухлина” (9
мишей, яким було перещеплено карциному Льюїс), ІІІ –„Пухлина + NSE 1 мг” (9
мишей-пухлиноносіїв, що приймали NSE по 1 мг) та IV –„Пухлина + NSE 5 мг” (9
мишей- пухлиноносіїв, що приймали NSE по 5 мг). В іншому експерименті
формувались групи „Пухлина + NSE з 4 дня” і „Пухлина + NSE з 21 дня”
2.1.2. Введення N-стеароїлетаноламіну та Цисплатину
Дослідження щодо розподілу N-пальмітоїлетаноламіну в органах щурів за умов його
введення per os, показали, що через 20 хв. після введення міченого NPE в
тканинах піддослідних тварин спостерігається приблизно 10 % мітки (сумарно),
відносно введеної дози [[cxlv]]. Виходячи з цих даних експерименту було обрано
такі дози NSE: 100 мг/кг маси тіла та 500 мг/кг маси тіла.
N-стеароїлетноламін (однорідна стабільна водна суспензія, що отримана за
допомогою ультразвукового диспергування) вводили per os по 1мг (50 мг/кг маси
тіла) та по 5 мг (250 мг/кг маси тіла) на тварину двічі на день, що в
перерахунку на добу складає 100 мг/кг маси тіла та 500 мг/кг маси тіла
відповідно. Початок введення препарату — з 4 дня після перещеплення і з 21 дня
після перещеплення до закінчення експерименту. Контрольним групам тварин
вводили рівну кількість дистильованої води. Тварин декапітували на 33 добу
після перещеплення. Кількість мишей в групах на кінець експерименту — 4-6.
Цисплатин (0,1 % водний розчин) готували безпосередньо перед використанням і
вводили групі мишей «Цисплатин» внутрішньоочеревинно по 0,2 мл на мишку 1 раз в
три дні, починаючи з 10 дня після перещеплення карциноми Льюїс. За умов досліду
тваринам-пухлиноносіям вводили per os N-стеароїлетноламін по 1мг та по 5 мг на
тварину двічі на день з 4 дня після перещеплення пухлини, а з 10 дня починали
вводити Цисплатин. Такі тварини були поділені в групи „Цисплатин + NSE 1 мг” і
„Цисплатин + NSE 5 мг”. Порівняльний аналіз проводили з групою
мишей-пухлиноносіїв „Контроль”.
2.1.3. Визначення інтенсивності росту пухлини та процесу метастазування
За динамікою росту пухлин слідкували за допомогою заміру діаметрів стегна
тварини в двох взаємно перпендикулярних площинах з періодичністю в 7 днів.
Гальмування росту пухлини розраховували в порівнянні з розмірами контрольної
групи тварин. При оцінюванні інтенсивності процесу метастазування
використовували такі критерії: середня кількість метастазів на тварину в групі,
середній об’єм метастатичного ураження легенів на тварину в групі. Метастази
кожної окремої тварини розподіляли за розміром візуально (діаметр метастазу
~0,5мм, 1 мм, 2 мм, 3 мм, 4 мм) для розрахунку об’єму метастатичного ураження
легенів.
Vм = D3 х р/6,
де Vм- об’єм метастазу певного розміру
D- діаметр метастазу, мм (0,5; 1; 2; 3; 4);.
Об’єм метастазу множимо на їхню кількість і складаємо в єдиний об’єм
метастатичного ураження легенів тварини (V):
V = Vм 0,5 + Vм 1 + Vм 2 + Vм 3 + Vм 4
2.1.4. Визначення кількості сечовини
Сечовину в плазмі крові визначали колориметричним методом за її реакцією з
диацетилмонооксидом. В кислому середовищі в присутності тіосемикарбазиду та
іонів Fe3+ сечовина утворює з діацетилмоноаксимом коплексну сполуку червоного
кольору, оптична плотність якого при довжині хвилі 510 нм пропорціональна
концентрації сечовини [[cxlvi]]. В роботі використовували тест-добірки фірми
„Sigma” “Urea nitrogen kits” згідно регламенту, описаного в цьому наборі.
Кількість сечовини визначали за калібровочним графіком, побудованому за
стандартними розчинами сечовини.
2.1.5. Визначення активності аргінази
В інкубаційне середовище, що містить 10 mM L-аргініну, 5 mM NaHCO3 (pH 9,5)
додавали 0,1 мл проби та інкубували протягом 60 хв. По закінченню часу
інкубації реакцію зупиняли додаванням до середовища 2н. хлорної кислоти (1 : 4,
кислота / проба). Після центрифугування проби (5 хв при 6000 об / хв) у
супернатанті визначали активність аргінази колориметричним методом за реакцією
з використанням диметилгліоксиму. Активність аргіназної реакції виражали в
нмоль сечовини за 1 хв на мг білку.
2.1.6. Визначення вмісту нітрит аніону ( NO2– )
Кількість NO2– визначали в колориметричній реакції за допомогою реактива Гріса
методом Гріна [ [cxlvii]] в модифікації [[cxlviii]].
Реактив Гріса готували, змішуючи рівні частини 0,1 % водного розчину
нафтилетилендіамінгідрохлориду з 1 % розчином сульфаніламіну в 5 % Н3РО4
безпосередньо перед визначенням. Визначення проводили в безбілковихаліквотах
проб, які готували таким чином: до 0,5 мл зразка додавали 0,1 мл
сульфосаліцилової кислоти, перемішували протягом 30 хвилин, потім
центрифугували при 3000 об/хв протягом 10 хв