РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал, що використовувся в роботі
Сполуки, що вивчались. Вивчали фізико-хімічні та біологічні властивості похідних хіноліну, синтез яких наведено у розділі 3. Структура та фізико-хімічні властивості - в таблицях 3.1 - 3.5.
Тварини. Дослідження проведено на білих безпородних мишах вагою 16 - 20 г, а також на білих щурах лінії Вістар вагою 140 - 260 г, яких було отримано з розплідника інституту фармакології та токсикології АМН України (м. Київ). Усі тварини обох статей утримувались на стандартному раціоні харчування.
2.2. Фізико-хімічні методи дослідження
Будову синтезованих сполук підтверджено ІЧ-спектрами, хромато- мас-спектрами. Індивідуальність - ПМР-спектрами, чистоту ? методом тонкошарової хроматографії у різних системах розчинників.
ІЧ-спектри записані на приладі "Specord IR-75" у таблетках калію броміду.
Хромато-мас-спектри знято на приладі "AGILENT 1100".
Спектри ПМР знято на приладі "Bruker AC 300" (300 МГц) у розчині ДМСО-d6 + CCl4 (1:1), внутрішній стандарт - ТМС.
Тонкошарову хроматографію проведено на пластинках "Silufol UV-254" у різних системах розчинників. Проявлення хроматограм здійснено за допомогою УФ-променів або парами йоду.
Визначення температури плавлення було проведено відповідно до вимог ДФ ХІ [136].
Ліпофільність сполук визначали за допомогою комп'ютерної програми Chem. Draw Ultra 6.0 в системі н-октанол ? вода. Ліпофільність виражали в log P, де Р - коефіцієнт розподілу сполуки між н-октанолом та водою.
2.3. Метод комп'ютерного прогнозування біологічної активності
Комп'ютерна програма PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) дозволяє здійснити прогноз спектра біологічної активності речовин на базі його структурної формули, включаючи фармакологічні ефекти й механізми дії [137]. Спектр біологічної активності містить у собі всю сукупність фармакологічних ефектів, біохімічних механізмів дії й видів специфічної токсичності, яку речовина може виявити при взаємодії з біологічними об'єктами. Біологічна активність визначається лише якісним чином (наявність/відсутність), що, звичайно, є досить грубим описом справжньої ситуації, але в рамках такого наближення в аналітичних і прогностичних цілях можна використовувати значний об'єм накопиченої попередньо інформації про біологічно активні сполуки [138].
Алгоритм роботи програми PASS базується на аналізі структурних дескрипторів багаторівневих атомних орбіталей. Цей набір дескрипторів генерується на основі структурної формули, що становить собою список атомів, які утворюють молекулу, і список зв'язків між ними для кожної хімічної сполуки.
Опис структури хімічних сполук у системі PASS базується на двомірних структурних формулах речовин, введення яких до комп'ютера може бути реалізоване за допомогою редактора структурних формул ISIS/Draw. При цьому стандартним поданням інформації в комп'ютер для однієї молекули є "mol", а для вибірки речовин - "sdf" файли.
Результат прогнозування видається у вигляді списку назв активностей з розрахунковими значеннями ймовірностей наявності (Ра) чи відсутності (Рі) кожного з видів активності.
Точність прогнозу, в середньому за всіма сполуками навчальної вибірки і всіма прогнозованими активностями, складає близько 85%.
2.4. Дослідження гострої токсичності S-заміщених похідних 2-метил-4-меркапто-8-метоксихіноліну
Вивчення гострої токсичності проводили на інтактних дорослих двостатевих мишах вагою 16 - 20 г [139, 140]. Сполуки, розчинені в фізіологічному розчині або у вигляді 3-5%-ної водної суспензії, стабілізованої твіном-80, вводили внутрішньочеревно. Контрольній групі тварин вводили фізіологічний розчин або твін-80 у тій же кількості, що й основній групі. Спостереження за тваринами проводили протягом 14 днів після одноразового введення речовин. Протягом цього часу спостерігали за поведінкою тварин, станом їх шкіри та слизових оболонок, нервовою збудливістю, кількістю живих і загиблих тварин. Середні летальні дози ЛД50 визначали за методом Прозоровського [141, 142].
2.5. Методи вивчення антиоксидантної активності S-заміщених похідних 2-метил-4-меркапто-8-метоксихіноліну у дослідах in vitro
2.5.1. Дослідження антирадикальної активності S-заміщених похідних 2-метил-4-меркапто-8-метоксихіноліну на моделі аутоокиснення адреналіну.
Дослідження антирадикальної активності синтезованих сполук проводили на моделі аутоокиснення адреналіну [143, 144].
У роботі використовували 0,1%-ний розчин адреналіну, 0,2 М бікарбонатний буфер рН=10,65. Розчини готували на бідистильованій воді. Величину оптичної щільності розчинів реєстрували на спектрофотометрі (СФ-46). Контрольні (бікарбонатний буфер + 0,1%-ний розчин адреналіну) та досліджені проби (бікарбонатний буфер + 0,1%-ний розчин адреналіну + розчин речовини) ставились в один і той же день і в однакових умовах. Концентрація речовини в розчині складала 125, 25, 5, 1 мкмоль/л. До 2 мл бікарбонатного буфера додавали 100 мкл 0,1%-ий розчин адреналіну, щільно та швидко перемішували, поміщали в спектрофотометр і вимірювали величину оптичної щільності при довжині хвилі 347 нм через 15 секунд упродовж 3 - 5 хв. Як еталон порівняння використовували L-ацетилцистеїн (рис. 2.1).
Рис. 2.1. L-ацетилцистеїн
Про величину антирадикальної активності S-заміщених похідних 2-метил-4-меркапто-8-метоксихіноліну робили висновок за процентом інгібування.
Процент інгібування обчислювали за формулою 2.1:
· 100% (2.1)
де ?Дд і ?Дк - різниця оптичної щільності швидкості реакції аутоокиснення адреналіну в присутності (дослід) та у відсутності сполуки (контроль), відповідно.
2.5.2. Дослідження антиоксидантної активності S-заміщених похідних 2-метил-4-меркапто-8-метоксихіноліну на моделі гальмування окиснення адр