Ви є тут

Біохімічні маркери апоптозу при лімфопроліферативних захворюваннях

Автор: 
Холіна Олена Анатоліївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U003617
129 грн
Додати в кошик

Вміст

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнялась в Луганском государственном медицинском университете на кафедре медицинской химии (зав. кафедрой - проф. И.А. Комаревцева) согласно общепринятым биоэтическим нормам, которые отвечают принципам Гельсинской декларации прав человека, Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицины, а также соответствующих Законов Украины относительно проведения экспериментальных и клинических исследований (протокол №17 от 29.11.2007г. заседания комиссии по биоэтике Луганского государственного медицинского университета).

2.1. Клиническая характеристика больных лимфопролиферативными заболеваниями
Образцы сыворотки и плазмы крови больных ходжкинскими лимфомами и неходжкинскими лимфомами собирались в период индукции-консолидации ремиссии или при проведении противорецидивного лечения в химиотерапевтическом отделении №3 на базе Луганского областного клинического онкологического диспансера.
За 2004-2005 гг. собрано и запротоколировано 510 образцов от 102 больных лимфопролиферативными заболеваниями до начала лечения. Для исследования были отобраны образцы от 74 больных.
Контрольную группу составили 30 практически здоровых доноров- добровольцев от 19 до 55 лет (31,9±2,6).
Средний возраст больных ХЛ от 18 до 58 лет (37±2,1), НХЛ от 21 до 71 (53,8±1,8) года. Обследованные были разделены на две группы. В первую группу вошли больные ХЛ - 41 человек, из них у 18 был морфологически верифицирован смешанно-клеточный вариант, у 15 - вариант нодулярного склероза, у 8 - вариант лимфоидного истощения. Вторая группа - больные НХЛ - 33 человека, из них у 21 верифицирована В-клеточная ЛС, а у 11 - Т-клеточная ЛС. Характеристика групп представлена в таблице 1.1.
Таблица 1.1.
Клиническая характеристика пациентов
Стадия1 группа (ХЛ)2 группа (НХЛ)IIn=19 (46%)n=11 (33%)IIIn=14 (34%)n=7 (21%)IVn=8 (20%)n=15 (45%)
Согласно критериям ВОЗ, диагноз ставился на основании цитологического, гистологического исследования периферических лимфатических узлов, которые были получены при диагностической операционной биопсии. При обнаружении экстранодальных опухолевых образований осуществлялась их биопсия. Выполнялось исследование клеток костного мозга и периферической крови. Исследовались также показатели свертывающей системы крови и ряд параметров, характеризующих состояние гуморального и клеточного иммунитета. У всех больных проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости и забрюшинного пространства, рентгенографическое исследование грудной клетки в трех проекциях, компьютерная томография грудной клетки, брюшной полости и области шеи с целью выявления увеличенных лимфоузлов. Инструментальные методы обследования включали также эндоскопическое исследование для выявления экстранодальных поражений, определения стадии основного процесса и других сопутствующих заболеваний внутренних органов.
Диагноз устанавливался в соответствии с классификацией А.И. Воробьева [1], в некоторых случаях согласно REAL-1994 г. [150,151].

2.2. Выделение мононуклеаров из крови больных
Забор крови проводили натощак. Мононуклеарные клетки выделяли из цельной гепаринизированной (15 Ед гепарина на 1 мл крови) венозной крови на градиенте плотности 1,077 г/см3 путём центрифугирования в горизонтальном положении 35 мин. при 400g. Полученное в интерфазе кольцо лимфоцитов отбирали и дважды отмывали физиологическим раствором натрия хлорида по 10 мин. при 400g. Супернатант отбирали, а клетки ресуспензировали в 1 мл физиологического раствора [152]. Следующим шагом после окрашивания 0,2% трипановым синим, был их подсчет в камере Горяева, доводя до рабочей концентрации 2?106 /мл по формуле [153]: А?5?V?10000, где
А - полученное количество клеток после подсчета
в 25 больших квадратах камеры;
"5" ? разведение;
V - объём суспензии клеток (откуда была получена проба для подсчета);
10000 - величина постоянная.

2.3. Количественное определение ДНК-фрагментации в лимфоцитах
Достоверно выявить все классические признаки апоптоза можно далеко не в каждом типе клеток, кроме того, не существует единого признака, который позволил бы установить механизм гибели клетки (посредством апоптоза или некроза) в каждом конкретном случае.
Различают несколько групп методов обнаружения и оценки скорости апоптоза. Каждая из них имеет свои достоинства и недостатки [154,155]. Первая группа включает биохимические методы, использующие некоторые обобщенные характеристики апоптоза, которые могут быть обнаружены в смешанных клеточных популяциях. Сюда можно отнести: выявление фрагментации ДНК с помощью гель-электрофореза [156,157], "туннельный" (от TUNEL - Terminal deoxynucletidyltransterase dUTP Nick End Labeling) [158,159], анализ расщепления субстратов каспазы с помощью вестерн-блоттинга [160] и изучение мембранного потенциала с флуоресцентными красителями [161]. Как уже было отмечено, одним из признаков, свидетельствующих об апоптозе, является деградация клеточной ДНК [162].
Выявлению ДНК-лестницы, которая возникает при гель-электрофорезе, некоторые авторы не придают решающего значения, так как этот метод имеет ряд недостатков. Он не отражает исходное апоптотическое расщепление ДНК на большие фрагменты, поскольку во время фракционирования или лизиса клеток часто происходит деградация ДНК, представляющая собой артефакт [163]. Кроме того, метод сложен для воспроизведения, а результаты не поддаются количественному анализу [164].
Учитывая этот факт, мы осуществляли детекцию апоптоза по определению фрагментации ДНК в мононуклеарных клетках на основании цветной реакции с дифениламиновым реагентом [165], но в нашей модификации ?166?. Её суть заключается в том, что гомогенат клеток сразу готовится в лизис-буфере (рН = 8). Этот метод в сравнению с ранее упомянутыми, является более экспрессным и дешевым.
Выделенные мон