РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктом експериментальних досліджень були фолікулярні ооцити, отримані з
яєчників клінічно здорових корів і телиць. Загальна схема досліджень наведена
на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Загальна схема досліджень.
Яєчники доставлялися в лабораторію з Київського м'ясокомбінату не пізніше як
через 1,5-2 години після забою тварин, у термосі зі стерильним фізіологічним
розчином (0,9% NaCl) та антибіотиками (100 од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл
стрептоміцину) при температурі +32 – +38°С. Для отримання ооцит-кумулюсних
комплексів використовували яєчники корів на стадії фолікулярного росту (рис.
2.2) або із пізнім жовтим тілом (рис. 2.3), в яких
Рис. 2.2 Яєчники корів на стадії фолікулярного росту.
спостерігали велику кількість видимих антральних фолікулів діаметром від 2 до 6
мм. У лабораторії яєчники спочатку два рази промивали теплим (+37 – +38°С),
фізіологічним розчином, а потім двічі – теплим фосфатно-сольовим розчином
Дюльбекко ("Serva") з антибіотиками (40 од/мл гентаміцину ("Reanal")).
Рис. 2.3 Яєчники корів з пізнім жовтим тілом.
Ооцити отримували надрізаючи лезом видимі антральні фолікули, вимивали
середовищем Дюльбекко з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") і
40 од/мл гентаміцину, виловлювали пастерівською піпеткою та три-чотири рази
відмивали у середовищі 199 ("Sigma"), яке містило 10% попередньо інактивованої
(+56°С, 30 хв.) фетальної сироватки корів ("Sera Lab."), оцінювали за
морфологічними ознаками [47, 115, 221] під контролем мікроскопу МБС-9 (рис.
2.4). Відмивання та оцінку гамет корів проводили на нагрівальному столику при
+37°С. Для заморожування і культивування використовували ооцити з гомогенною
тонкозернистою ооплазмою, непошкодженою прозорою оболонкою, щільним або
частково розпушеним кумулюсом.
Рис. 2.4 Популяція незрілих ооцитів отриманих з яєчників корів. Збільшення 56х
(об. 4х, ок. 14х).
Заморожування ооцит-кумулюсних комплексів проводили шляхом занурення пайєт з
гаметами в рідкий азот. Схема заправки пайєти подана
рис. 2.5. При цьому використовували еквілібраційний і вітрифікаційний
А Б В Г В Д Е
Рис. 2.5 Схема заправки пайєти вітрифікаційним розчином з біооб’єктом.
А – пробка, Б – розчин сахарози, В – повітря, Г – вітрифікаційний розчин з
біооб’єктом, Д – вітрифікаційний розчин, Е – полімерна пробка
розчини. Перед заморожуванням гамети корів з найменшою кількістю культурального
середовища переносили до еквілібраційного розчину
(рис. 2.6), яке складалось з 10% гліцерину ("Sigma"), 20% пропандіолу
Рис. 2.6 Кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів. Обробка гамет
еквілібраційним розчином кріопротекторів. Збільшення 56х (об. 4х, ок. 14х).
("Sigma"), 20% фетальної сироватки корів у фосфатно-сольовому буфері Дюльбекко.
Еквілібрацію клітин проводили протягом 10 хв. при кімнатній температурі. Потім
ооцит-кумулюсні комплекси переносили на 30 сек. у вітрифікаційний розчин
(25%-ний гліцерин, 25%-ний пропандіол, 20% фетальної сироватки корів у
фосфатно-сольовому буфері Дюльбекко), попередньо охолоджений до +4°С, вміщували
у 0,25 мл пластикові пайєти (рис. 2.7) і занурювали у рідкий азот (-196°С)
(рис. 2.8)
Рис. 2.7 Кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів. Вміщення гамет в
пайєту.
Рис. 2.8 Кріоконсервування ооцит-кумулюсних комплексів корів. Занурення пайєт у
рідкий азот.
Розморожування кріоконсервованих гамет корів проводили у водяній бані при +4°С
протягом 5 сек., попередньо видаливши із пайєти полімерну пробку. Потім
ооцит-кумулюсні комплекси переносили у 1,0 M розчин сахарози. Після 10
хвилинної експозиції у цьому розчині клітини тричі відмивали середовищем 199 з
10%-ною фетальною сироваткою корів і
40 од/мл гентаміцину, оцінювали під мікроскопом за морфологічними ознаками і
переносили в середовище для культивування. Для експрес-оцінки життєздатності
ооцит-кумулюсних комплексів в деяких дослідах після
заморожування-розморожування використовували метод вітального забарвлення
клітин 0,4% розчином трипанового синього (рис. 2.9).
Рис. 2.9 Вітальне забарвлення ооцитів корів розчином 0,4% трипанового синього.
Збільшення 98х (об. 7х, ок. 14х).
Збереженість гамет корів після деконсервування оцінювали за морфологічними і
цитогенетичними показниками, результатами вітального забарвлення та
культивування. Дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів поза організмом проводили
в присутності клітин гранульози, концентрація якої складала 3-6x106 клітин у 1
мл культурального середовища, в чотирилункових планшетах ("Costar") протягом 27
год. при температурі 38,5°С та 5%-ному вмісті СО2 в повітрі, у краплях
середовища 199 з 10%-ною попередньо інактивованою сироваткою корів, або з
додаванням 2,5 мкг/мл ФСГ ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадіолу
("Serva"), 2,5 МОд/мл лютеїнізуючого гормона ("Serva"), 2,0 мМ натрію пірувату
("Sigma"),
2,92 мМ кальцію лактату ("Sigma"), 40 мкг/мл гентаміцину.
Клітини гранульози отримували з антральних фолікулів діаметром від 2 до 6 мм
без видимих ознак атрезії. Для цього фолікули ізолювали із строми яєчника за
допомогою ножиць, а потім ізольовані фолікули переносили у середовище 199, там
їх розривали, відмивали від залишків оточуючих тканин і фолікулярної рідини та
скарифікували внутрішню поверхню фолікула за допомогою металевого шпателя.
Розрідження одержаної суспензії здійснювали інтенсивним піпетуванням з
використанням пастерівської піпетки.
З метою оцінки стадії мейотичного дозрівання поза організмом деконсервованих і
нативних (контрольна група) ооцит-кумулюсних комплексів корів та виявлення
хромосомних порушень у гамет пр