РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали, що використані в роботі
Кристалічну отруту щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) та ефи багатолускової (Echis multisquamatus) одержували з серпентарію Трипільського біохімічного заводу.
Було використано такі матеріали та реактиви: Супероза 12В, цибакрон-сефароза, Q-сефароза, алкіл-сефароза, Lys-Sepharose, Sephadex G-100, Sephacryl S-300 ("Pharmacia", Швеція), сефакрил S-300 (Amersham Bioscience, США); інгібітори протеїназ: ЕДТА ("Serva", США), бензамідин (Sigma, США), дітіотриетол ("Reanal", Угорщина), іодацетамід (Хімреактив, СРСР), ДФФ ("Merck", Німеччина), пНФГБ ("Sigma", США), ПХМБ ("Chemapol", Чехія), СІТ; ?-МЕ ("Serva", США); ДS-Na ("Sigma", США ); акріламід ("Sigma", США); біс-акріламід ("Aldrich", Англія); азид натрію (NaN3) ("Aldrich", Англія); ефіри амінокислот ВАЕЕ, ВАМЕ, ТАМЕ (всі реагенти фірми "Sigma", США); хромогенні субстрати плазміну - S2251, тромбіну - S2238, фактора Ха - S2765, протеїну С - S2366 (усі субстрати виробництва "Chromogenic", Швеція), Хромозим 236 (Kabi Vitrum, Швеція); тромбіновий хромогенний субстрат хромозим-238 (D-Фен-L-Піп-L-Арг-п- н(троан(л(д) (Аmerican Diagnostica Inc., США);плазміновий хромогенний субстрат S2251 (L-Вал-L-Лей-L-Л(з-п-н(троан(л(д) (одержаний з Інституту молекулярної біології НАН України).
DS-Na, b-меркаптоетанол, суміш білків - маркерів для електрофорезу, стрептокіназа Kabikinase (" Pharmacia" AG, Швеція); трис, ("Диа-М", Росія), трис-гідроксиметиламінометан (Германія); ДСН-додецилсульфат натрію (Bio-Rad Laboratories); АЧТЧ-реагент ("bioMerieux", Франція), тромбопластин ("Ренам", Росія); планшети для ІФА (Linbro, Flow Laboratories Inc., США).
Решта реактивів ступеню чистоти "хч" та вище вітчизняного виробництва.
Фібриноген бика (98%-ного згортання) одержували з плазми крові шляхом висолювання 16% розчином сульфату натрію з наступним відділенням кріофібриногена за методом Варецької. Питоме поглинання фибриногену - 15,06. [280].
Фібрин-мономер дезААВВ одержували активацією фібриногену тромбіном з наступним розчиненням згустку в 20мМ оцтовій кислоті при 0°С. Препарат зберігали при 4°С на протязі 3-4 тижнів [281].
Фібрин-мономер дезАА отримували, діючи на фібриноген анцистроном - фібриноподібним ферментом, який виділяли з отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) [282].
Стабілізований фібрин отримували із препаратів фібриногену, який містив домішки фактору XIII. Стабілізацію фібрину проводили при 200С 15 годин в 0,05 М трис-НСl буфері рН 7,4, 0,13 М NаСl, 2?10-2 М СаСl2, 0,5 NІН одиниці тромбіну на мг фібриногену.
Фрагменти фібрину DD та Е отримували гідролізом стабілізованого фібрину, який проводили плазміном [283]. Тривалість гідролізу для отримання фрагменту Е1 складала 4-5 годин, фрагменту Е3 - 24 години за температури 20оС. Інгібування гідролізу проводили 5?10-5 М ДФФ з наступним видаленням плазміну методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі.
Для отримання комплексу DD-Е використовували іонообмінну хроматографію на КМ-Сефадексі. Матеріал наносили в 0,01 М фосфатному буфері рН 6,0. Швидкість нанесення та швидкість елюції складала 1,0 мл/см2/хв. Елюцію матеріалу, що зв'язався з колонкою, проводили в 0,1 М фосфатному буфері рН 7,4, 0,3 М NаСl [283]. Гомогенність одержаного білка перевіряли методом ДS-Na електрофорезу.
Е-фрагмент фібрину, що входить до складу (DD)E комплексу, відокремлювали від D-димеру методом гель-фільтрації на сефакрилі S-300 (2х115 см), в 0,05 М трис-HCl буфері, pH 7.4, який містить 1 М KCNS, зі швидкістю 0,8 мл/см2/хв. Е280 1% - 10,0
Фрагмент D фібриногену одержували гідролізом фібриногену, який проводили при 37°С у 0,05 М трис-НСІ буфері rH 7.4? у присутності 0,001 М СаСI2. Концентрація фібриногену - 14 мг/мл? активність плазміногену - 0,2 к.о./мл, стрептокінази - 50 од/мл. Гідроліз проводили протягом 6-8 годин. Реакцію зупиняли додаванням 6-аміногексанової кислоти до 0,2М і соєвого інгібітора трипсину в певній кількості. Як антисептик використовували азид натрію в концентрації 10-3М. Плазмін одержували на Lys-сефарозі.
Для виділення фрагментів використовували іонообміну хроматографію на КМ-сефадексі С-50 (колонка 1?7х15?0 см). Матеріал наносили в 0,01 М фосфатному буфері рН 6,0. Швидкість нанесення та швидкість елюції складала 1,0 мл/см2/хв. Елюцію матеріалу, що зв'язався з колонкою, проводили в 0,1 М фосфатному буфері рН 7,4, 0,3 М NаСl. Очищення фрагменту Е3 проводили на Сефакрилі S-200. Гомогенність одержаного білка перевіряли методом ДS-Na електрофорезу. Отримані препарати діалізували проти 0,05 трис-HCl буферу з 0,15 М NaCl pH 7,4. Е280 1% - 20,0 Зберігали при -200 С. [283].
Фрагмент бромцианового розщеплення фібрину і фібриногену N-DSК отримували шляхом гідролізу фібриногена бромцианом з подальшою очисткою методом гель-фільтрації на сефадексі G-100 [208, 285]. Препарат ліофілізованого фібриногену людини розчиняли у 0,1 М фосфатному буфері pH 7,0 при 370С до концентрації 25 мг /мл. Для інактивації фактору ХІІІ (трансглутамінази) у розчин вносили монойодоцтову кислоту до концентрації 1,6% і залишали у темному місці на 24 год. Діалізували проти 0,05 М фосфатного буферу з 0,1 М NaCl pH 7,6. Центрифугували при 2 тис об/хв і визначали концентрацію білка.
Розчин розводили 0,05 М фосфатним буфером pH 7,6 з 0,1 М NaCl до концентрації 0,25% і додавали тромбін з розрахунку 0,5 NіH на 1 мг фібриногену. Суміш інкубували протягом 2,5 год при 370 С. Утворений фібрин-мономер розчиняли у 0,125% оцтовій кислоті, центрифугували при 2 тис. об/хв, визначали концентрацію білка і переосаджували 0,06 М фосфатним буфером рH 6,0 з іонною силою 0,34.
Препарат промивали у фізіологічному розчині і розчиняли у 75% мурашиній кислоті. Реакцію з бромцианом проводили у середовищі інертного газу (аргону). Суміш залишали на 24 год. Діалізували проти бідистильованої води зі змінами кожні 30 хв.
Отриманий препа