РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Загальна характеристика об’єктів та методів дослідження
Для розкриття біохімічних механізмів дії іонів кадмію згідно з метою
дослідження доцільним було проведення експериментів на теплокровних тваринах,
отруєних хлоридом кадмію. Об’єктом дослідження слугували нелінійні (інбредні)
щури – самці, масою 140-180 г, яким одноразово внутрішньом’язово вводили розчин
хлориду кадмію у дозі 1/5 ЛД50, (що відповідає 12 мг/кг маси тіла), та тварини,
яким хлорид кадмію вводили протягом 10-ти днів (щоденна доза становила 1/50
ЛД50, тобто 1,2 мг/кг). Розрахунок необхідної для введення кількості речовини
проводили, виходячи з даних про параметри токсичності хлориду кадмію, наведені
у літературі Трахтенберг І.М. [193], Сидоренко Г.И. і співавт. [194], Штабський
Б.М. та ін. [195] з розрахунку на чистий елемент. Матеріал для дослідження
забирали в гострому експерименті через 1, 2, 4, 6, 12 і 24 години після
введення хлориду кадмію. При багаторазовому введенні токсиканту забір матеріалу
проводився на 1, 7, 14, 21, 28 діб після завершення введення хлориду кадмію.
Тварини утримувались в умовах стандартного харчового раціону віварію.
Згідно з поставленими задачами за умов багаторазового введення хлориду кадмію
проводилось вивчення впливу унітіолу та селеніту натрію. У зв’язку з цим
тварини (n=432) були розділені на групи:
контрольна група (інтактні) яким вводили фізіологічний розчин;
група №1 – тваринам вводили хлорид кадмію одноразово в дозі 1/5 ЛД50 ;
група №2 – тваринам вводили хлорид кадмію протягом 10-ти днів в дозі 1/50 ЛД50
;
група №3 – тварини, яким після завершення введення хлориду кадмію,
внутрішньом’язово вводили щоденно унітіол в дозі 5 мг/кг маси тіла протягом
відповідних періодів дослідження;
група №4 – тварини, яким після завершення введення хлориду кад-мію, вводили
щоденно внутрішньом’язово селеніт натрію в дозі 30 мкг/кг маси тіла протягом
відповідних термінів.
Програма досліджень включала такі розділи:
вивчення структурно-функціонального стану еритроцитів за еритроцитарними
індексами, кислотною резистентністю мембрани еритроцитів, жирнокислотним
складом ліпідів, ступенем окиснювальної модифікації білків, антиоксидантним
захистом (активністю каталази);
вивчення стану середовища існування еритроцитів за інтенсивністю процесів
пероксидного окиснення ліпідів плазми крові (жирнокислотний склад ліпідів,
хемілюмінесцентний аналіз, рівень дієнових кон’югатів і ТБК-активних
продуктів), ступенем окиснювальної модифікації білків плазми крові, балансом
про- і антиоксидантних систем (насиченість трансферину плазми крові і
активність церулоплазміну);
вивчення функціональної здатності гемоглобіну за спектральними
характеристиками, співвідношенням лігандних форм гемоглобіну, інтенсивністю
відновлення метгемоглобіну, параметрами киснево-транспортної функції;
вивчення структури внутрішніх органів шляхом гістологічного та
ультрамікроскопічного дослідження тканин внутрішніх органів.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Гематологічні методи дослідження. Згідно із сучасними уявленнями, для
адекватної оцінки функціонування системи еритрону необхідно застосовувати
інтегральні критерії, що характеризують не окремі компоненти, а роботу системи
в цілому. Нами вибрані критерії, які в певній мірі характеризують систему
еритрону, зокрема: кількість еритроцитів та ретикулоцитів, вміст загального
гемоглобіну, вивчення еритроцитарних індексів та кислотної стійкості
еритроцитарних мембран.
Для характеристики периферичної ланки еритрону використовували загальноприйняті
гематологічні методи дослідження [196, 197]:
підрахунок числа еритроцитів проводили у камері Горяєва;
визначення числа ретикулоцитів шляхом мікроскопії з використанням метиленового
синього;
гематокрит визначали за уніфікованою методикою [196];
середній об’єм еритроцита вираховували за формулою - гематокрит
(л/л)Ч1000/число еритроцитів (Ч1012/л);
середній вміст гемоглобіну в одному еритроциті визначали за фор-мулою –
гемоглобін (г/л)/число еритроцитів (Ч1012/л);
концентрацію загального гемоглобіну в крові визначали гемогло-бінціанідним
методом.
2.2.2. Визначення кислотної резистентності еритроцитів. Функційний стан
плазматичних мембран еритроцитів оцінювали за допомогою визначення кислотної
резистентності еритроцитів кінетичним методом [198, 199]. Суть методу полягає у
визначенні динаміки клітин, що гемолізують під дією слабкої кислоти за певний
проміжок часу. Цей метод надає можливість оцінити внесок різних чинників у
кінетику проходження протона через плазматичну мембрану еритроцитів і визначити
співвідношення між різними за кислотною стійкістю формами еритроцитів.
2.2.3. Спектрофотометричні методи визначення лігандних форм гемоглобіну.
Гемоглобін може приєднувати цілий ряд лігандів, перетво-рюючись в окси-, мет-,
сульф- та інші форми. Якісні та кількісні характери-стики лігандних форм
гемоглобіну ґрунтуються на їхніх спектральних влас-тивостях. Для
оксигемоглобіну характерні два максимуми поглинання – 541 і 547 нм, для
метгемоглобіну – 500 і 630 нм, для сульфгемоглобіну – 620 нм [42].
Для запису спектрів лігандних форм гемоглобіну еритроцити гепарині-зованої
крові тричі відмивали ізотонічним розчином хлориду натрію і гемолі-зували 1/30
М Na/K фосфатним буфером, рН=7,36. Електронні спектри записували за допомогою
спектрофотометра „Speсord M – 40” (Німеччина).
Визначення вмісту оксигемоглобіну, метгемоглобіну і сульфгемоглобіну проводили
за методиками, описаними Кушаковським М.С. 158] та Сухомлиновим Б.Ф. і співавт.
[200] відповідно до максимумів погли-нання кожної лігандної фор
- Київ+380960830922