РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Методика вибору режимів моночастотного та стохастичого ультразвуку для
терапевтичних цілей
2.1.1. Умови озвучення тварин
Дослідження реакцій клітин і тканин на дію моночастотного і стохастичного
ультразвуку різних інтенсивностей були проведені на 200 білих безпородних
статевозрілих щурах вагою 180- 200 г.
Тварин дослідних груп (n=6-10) озвучували в області піднебінних дужок. Перед
процедурою волосяний покрив на місці дотику аплікатора видаляли безпечною
бритвою. Як контактне середовище використовували дезодоровану вазелінову олію.
Джерелом ультразвуку як моночастотного, так і стохастичного режимів був апарат
“Тератон-V”. Крім того, застосовували розроблений I.В.Островським та O. Т.
Марченком [ 339 ] експериментальний терапевтичний апарат для генерації
стохастичного ультразвукового сигналу. Як джерело моночастотного ультразвуку
використовували також прилад УЗТ-3.04ІЗ. Частота моночастотного ультразвуку
становила 0,88 МГц, а стохастичного змінювалась в діапазоні 0,88-2,64 МГц.
При вивченні впливу моночастотного та стохастичного ультразвуку на перекисне
окиснення ліпідів, активність ендогенних антиоксидантів, на вміст і
перерозподіл відновлених і окиснених форм нікотинамідаденін динуклеотидних та
нікотинамідаденін динуклеотидфосфатних коферментів тварин піддавали
10-хвилинному озвученню. Інтенсивність УЗ моночастотного і стохастичного
режимів становила 0,2 Вт/см2 , 0,3 Вт/см2, 0,5 Вт/см2 та 1,0 Вт/см2.
Дослідження проводили через 3 год, 24 год та 48 год після дії ультразвуку.
Окрім одноразової дії моночастотного та стохастичного ультразвуку, досліджували
також його курсовий вплив. Для цього проводили п’ятиразове озвучення (по 10 хв
через добу протягом десяти діб).
При дослідженні впливу моночастотного та стохастичного ультразвуку на
проникність мембран еритроцитів, активність АТФ-аз та функціональну активність
лімфоцитів крові застосовували СТУЗ з інтенсивностями 0,12 Вт/см2, 0,25 Вт/см2,
і 0,5 Вт/см2, а МУЗ - з інтенсивностями 0,1 Вт/см2, 0,3 Вт/см2, 0,5 Вт/см2.
Проводили курсове озвучення. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом
через 3 год після останнього сеансу.
В усіх серіях дослідів в якості контрольної використовували групу тварин, яким
проводили так зване „вдаване озвучення”, що являло собою імітацію процедури
озвучення, але при відключеному генераторі ультразвукового сигналу.
2.1.2. Оцінка стійкості еритроцитів до гемолізу
Зміни в структурі і функціях мембран розглядають як один з основних механізмів
дії ультразвуку. Частним аспектом проблеми є вивчення проникності клітинних
мембран. Найбільш доступним матеріалом для дослідження, а також в клінічній
практиці являються клітини крові, в першу чергу - еритроцити. Існують
відомості, що з певною долею ймовірності, дані про проникність еритроцитарних
мембран можуть розглядатися як показники „загальної” проникності. Одним з
способів дослідження проникності еритроцитарних мембран є визначення їх
осмотичної резистентності. Нашу увагу привернув тест визначення осмотичної
резистентності еритроцитів до розчинів сечовини різної концентрації [ 8 ].
Еритроцити отримували трикратним промиванням крові в ізотонічному розчині
хлориду натрію з наступним центрифугуванням 10 хв при 300 g. До 0,6 мл
отриманої суспензії еритроцитів додавали 5 мл натрій-фосфатного буферу ( 5
ммоль, рН 7,4 ), що містив 0, 425 % NaCl. Після інкубації 15 хв при 37 єС по
0,5 мл взвису поміщали в 4 центрифужні пробірки. Потім в 3 пробірки додавали по
5 мл робочого розчину сечовини (18 г/л) і хлориду натрію ( 8,5 г/л) в слідуючих
об’ємних співвідношеннях – 40:60, 50:50, 60:40. В четверту пробірку додавали 5
мл ізотонічного розчину сечовини. Ця пробірка була еталоном 100 % гемолізу
еритроцитів. Проби перемішували, через 2-3 хв центрифугували і вимірювали
оптичну густину надосадкової рідини при 540 нм на спектрофотометрі СФ-46 (ЛОМО,
Росія ). Процент гемолізу розраховували за оптичною густиною по відношенню до
оптичної густини еритроцитів в ізотонічному розчині сечовини, де відбувався 100
% гемоліз.
2.1.3. Визначення параметру синтетичної активності лімфоцитів крові
Параметри функціональної активності лімфоцитів крові визначали за допомогою
флуоресцентного барвника акридинового оранжевого. Цей барвник, зв’язуючись з
нуклеїновими кислотами фіксованої лімфоїдної клітини, змінює світіння клітини в
світлі, що проходить, і дозволяє вловити світіння в червоній і зеленій смузі
спектру. При дослідженні клітин в червоній області спектра (640 нм) виникає
світіння однонитчастих РНК. При дослідженні в зеленій області спектра (530 нм)
виникає світіння двоспиральних ДНК. Співвідношення РНК і ДНК (РНК/ДНК) в
лімфоциті є показником одного із параметрів функціонального стану клітини і
визначається як параметр б [ 32 ]. Для проведення досліджень 0,5 мл крові
відстоювали в термостаті при температурі 37 єС протягом 20-30 хв. Отриману
плазму у співвідношенні 1:1 розводили розчином середовища 199. Із 0,02 мл
отриманого розчину виготовляли мазок. Висушений мазок фіксували послідовно: 20
хв – сумішшю 96 % етилового спирту з ацетоном (1:1); 15 хв – 96 % етиловим
спиртом; 10 хв – 60 % етиловим спиртом; 5 хв – 30 % етиловим спиртом. Далі
мазок промивали дистильованою водою і на 4-5 хв поміщали в цитрат-фосфатний
буфер (рН 4,2). Оброблений таким чином мазок забарвлювали акридиновим оранжевим
в концентрації 1:25000 протягом 10 хв. [ 27 ]. Інтенсивність флуоресценції
клітин в областях 640 нм (для РНК) і 530 нм (для ДНК) реєстрували на
люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ И-3. Ініціацію флуоресценції здійснювали
довжиною хвилі 436 нм
- Київ+380960830922