РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконана на експериментальному та клінічному матеріалі з використанням імунологічних, клінічних, морфологічних, біотехнологічних, біофізичних, фізико-хімічних і статистичних методів.
2.1. Експериментальні тварини
В експериментах використовували мишей ліній СВА (430 шт.), BALB/c (350 шт.), C57Bl/6 (680 шт.), масою (18-20) г, отриманих з розплідника "Столбовая" (Російська Федерація), віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України (ІЕПОР НАНУ) та Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України; неінбредних мишей (250 шт.) і щурів-самців (400 шт.), масою (110+10) г стадного розведення віварію Інституту онкології АМН України (ІО АМНУ).
2.2. Моделі пухлинного росту
Дослідження проведено на стандартних моделях пухлинного росту: карцинома легені Льюїс (3LL), меланома В16 і карцинома Герена (КГ). Всі пухлинні штами одержані з лабораторії експериментальних клітинних систем ІЕПОР НАНУ, де вони підтримувались згідно загальноприйнятих методик.
Карциному 3LL перещеплювали під шкіру стегна мишам C57Bl/6 шляхом інокуляції 0,2 мл суспензії, що містила 2,5х105 життєздатних пухлинних клітин [324]. Метастазуючу меланому В16 перещеплювали під шкіру стегна мишам C57Bl/6 шляхом інокуляції 3х105 життєздатних пухлинних клітин в об'ємі 0,2 мл культурального середовища. КГ перещеплювали під шкіру стегна щурів введенням 25-відсоткової (за осадом клітин) суспензії пухлинних клітин в об'ємі 0,5 мл середовища 199.
В окремому дослідженні, в якості експериментальної моделі пухлинного росту була використана внутрішньоорганна трансплантація КГ в паренхіму селезінки [325] і печінки щурів [326]. Трансплантацію КГ в тканину селезінки проводили під ефірним наркозом, після відповідної обробки шкіри робили верхню лапаротомію та мобілізацію селезінки. У середній частині органа (місце його максимальної товщини) браншею очного пінцета проколювали тканину селезінки (на 2-3 мм), канал розширювали і тим же пінцетом у нього занурювали фрагмент пухлинної тканини об'ємом (1,0-1,5) мм3. Тварин декапітували під ефірним наркозом на 7-, 10-, 14-, 18-, 22- і 25-у добу пухлинного росту. Тим же способом трансплантували КГ в тканину печінки. Дослідження проведені в такі терміни: на 7-, 14-, 21- і 26-у добу від перещеплення пухлини. На кожен термін дослідження брали не менш 5 тварин. Контролем були псевдооперовані щури на 3- і 7-у добу після операції.
Перебіг експериментального пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками. Визначали частоту прищеплення пухлин, латентний період, середню тривалість життя (СТЖ) тварин, розміри (об'єм) первинної пухлини та кількість і розміри метастазів [327, 328]. При визначенні об'єму метастазів форму метастатичних вузлів приймали за сферичну. Розрахунки проводили після вимірювання діаметру (d) кожного метастазу за формулою [327]: V=0,52d3 .
Розраховували індекс гальмування росту пухлин як описано [329]. Інтегральний критерій ефективності протипухлинної терапії - індекс росту (ІР), який характеризує її сукупний ефект і враховує не тільки виразність протипухлинної дії, але і її тривалість, розраховували за формулою:
,
де Sд - площа під кінетичною кривою росту пухлини в дослідній групі; Sк - площа під кінетичною кривою росту пухлини в контрольній групі.
Оцінку способу внутрішньоорганного щеплення пухлин (в селезінку та печінку) проводили на макропрепаратах в динаміці росту пухлинних інокулятів, а також на гістологічних препаратах, взятих з пухлинної тканини на її межі з тканиною селезінки або печінки. На морфологічне дослідження забирали: пухлину, тимус, мезентеріальні лімфатичні вузли, селезінку та печінку (на відстані від пухлинного трансплантату). В процесі внутрішньоорганного росту пухлинного трансплантату нами було виділено три стадії: І - стадія запалення (від моменту імплантації до 7-ї доби). Хірургічне втручання викликає у тварин стресову реакцію та імунодепресивний стан, що сприяє досить ранньому приживленню пухлинного трансплантату та дає змогу контролювати макроскопічні зміни (характер росту інокулята), проводити морфологічні дослідження вже на 3-ю добу. Морфологічні зміни в органах імуногенезу ми досліджували, починаючи із 7-ї доби після трансплантації пухлини, коли згасали гострі явища запального характеру.
- II - стадія активного росту пухлинного трансплантату тривалістю від 10 до 18 діб.
- ІІІ - стадія генералізації пухлинного процесу, яка триває від 18- до 25-ї доби і більше, з розповсюдженням пухлинних імплантатів по вісцеральній та парієтальній очеревині з ураженням брижи, що супроводжується реактивним збільшенням мезентеріальних лімфатичних вузлів (ЛВ).
2.3. Моделі імунологічної недостатності
Пізню тимектомію (ТЕ) у мишей проводили під гексеналовим наркозом з урахуванням рекомендацій М.Haimov і співав. [330]. Тварин брали в дослід через 1 міс. З метою відновлення ендокринної функції тимуса мишам вводили тималін внутрішньом'язово по 100 мкг (сумарна доза 400 мкг) або трансплантували в черевну порожнину сингенний тимус (у дифузійній камері, під гексеналовим наркозом) за 10 днів до початку експерименту.
Гідрокортизон вводили щурам одноразово внутрішньом'язово (150 мкг на 1г маси тіла). Через 72 год виділяли кортизон-резистентні клітини з тимуса і селезінки за загальноприйнятою методикою.
2.4. Методи дослідження
Мононуклеари периферичної крові та поліморфноядерні лейкоцити виділяли на двоступінчастому градієнті щільності фікол-верографіну (d=1,077 і 1,12 г/см3 відповідно). Клітини лімфоїдних органів (тимуса, селезінки, ЛВ) одержували шляхом механічної дезинтеграції тканини. Від домішки еритроц