Біохімічні механізми порушень метаболічних процесів при експериментальному гіпертиреозі та їх корекція за допомогою похідних 2-оксо-4-гідроксихіноліну

Р О З Д І Л 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Вибір об'єктів та методів дослідження для виконання експериментальної частини даної роботи здійснювався відповідно до поставленої мети, яка передбачала вивчення біохімічних механізмів порушень метаболічних процесів при експериментальному гіпертиреозі різного генезу та їх корекції за допомогою похідних 2-оксо-4-гідроксихіноліну як перспективної нової хімічної групи активних сполук з антитиреоїдними властивостями та дослідження біохімічних механізмів дії найбільш перспективних з них.
В останні роки з метою підвищення ефективності і зниження собівартості проведення фармакологічного скринінгу на лабораторних тваринах нових природних та синтетичних сполук використовується математичний прогноз різних видів біологічної активності та аналіз зв'язку "структура-активність" [72, 114, 123, 137, 163]. В Національному фармацевтичному університеті був проведений "розрахунковий скринінг" для хімічної групи - 2-оксо-4-гідроксихінолінів. Прогноз біологічних властивостей речовин зазначеного класу здійснено з використанням комплексу програм ОРАКУЛ (Оптимизированный Распознающий Алгоритм Конструирования Усовершенствованных Лекарств), розробленого сумісно НДІ по БДХС та Інститутом органічного синтезу Латвійської академії наук [35].
Для вирішення поставлених задач як об'єкт дослідження були узяті похідні 2-оксо-4-гідроксихіноліна. Дані речовини вперше синтезовані на кафедрі фармацевтичної хімії Національного фармацевтичного університету під керівництвом доктора хімічних наук, професора Українця І.В.
Будову синтезованих сполук підтверджено даними елементного аналізу УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, масспектрометрії [132], а в деяких випадках зустрічним синтезом. Індивідуальність речовин установлена методом тонкошарової хроматографії.
Дані речовини являють собою білі чи слабо забарвлені кристалічні речовини без запаху, розчинні в ДМФА, ДМСО. Температура плавлення їх коливалася від 137 до 440?С (з розкладанням). Сполуки, які важко розчинялися у воді, вводили лабораторним тваринам у вигляді тонкодисперсної водної суспензії, стабілізованої твіном-80, що являє собою продукт оксиетилювання моноолеата сорбітану (ВФС-42-167-72).
Біологічну активність досліджуваних сполук порівнювали з лікарським препаратом мерказолілом (тіамазолом), виробництва ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоровя", Україна; вводили тваринам в дозї 10 мг/кг маси тіла, що відповідає вимогам діючих специфікацій [46, 94].
Вивчення біологічної активності досліджуваних органічних речовин було проведено відповідно до вимог фармакологічного скринінгу [101].
Вивчення гострої токсичності сполук проводили на інтактних білих мишах обох статей масою 18-24 г по п'ять тварин у серії з кожною досліджуваною дозою. Речовини у вигляді 3% тонкої водної суспензії, стабілізованої твіном-80, уводили перорально. Контрольній групі тварин вводили аналогічний об'єм розчинника. Кількість тварин, що вижили, відзначали кожні 24 години протягом 14 діб. Середньосмертельні дози (ДЛ50) розраховували за методом Кербера [15, 63].
Крім того, була вивчена гостра токсичність експрес-методом по Пастушенко Т.В. із співавт.[105]. Дослідження проводили при одноразовому пероральному і внутрішньоочеревинному введенні на мишах і на щурах. Попередні дослідження проводили на двох тваринах на кожну дозу: в інтервалі доз від 1000 мг/кг до 5000 мг/кг. Спостереження за тваринами проводили протягом двох тижнів. Ефект оцінювали по співвідношенню "загибель тварин/кількість тварин". Для точного встановлення показника ДЛ50 проводили додаткові, відповідно до методики, дослідження в інтервалі доз, виділених шкалою, з огляду на попередні досліди [102]. Клас токсичності визначали за класифікацією К. К. Сидорова [125].
Експериментальне вивчення специфічної антитиреоїдної дії похідних 2-оксо-4-гідроксихіноліну складалося з трьох етапів: а) первинний скринінг на інтактних тваринах; б) вивчення механізмів специфічної дії на експериментальних моделях гіпертиреозу; в) біотестування за умов in vitro на отриманій субопераційно ЩЗ хворих на тиропатії. Вивчення антитиреоїдної активності на декількох моделях дозволяє оцінити вплив досліджуваних сполук на стан ЩЗ у нормі та при патології і є базовою основою для подальшого поглибленого вивчення механізмів їхньої дії [46, 67, 94].
Тварини утримувалися в оптимальних умовах віварію з забезпеченням температурного та світлового режимів, повноцінного харчування, захисту від інфікування [49].
Вивчення антитиреоїдної активності (первинний скринінг) похідних 2-оксо-4-гідроксихіноліну проводили за стандартним методом "зобної" реакції, заснованому на компенсаторному збільшенні щитоподібної залози за впливу тиреостатиків [46]. Для дослідів використовувалися щури-самці. Тривалість експерименту становила 10 діб. Як препарат порівняння використовували відомий тиреостатик мерказоліл (тіамазол), виробництва ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоровя", Україна, який вводили тваринам в ефективній дозі 10 мг/кг маси тіла, яка викликала максимальне зниження тиреоїдних гормонів в сироватці крові (до 50-70%) [94]. Контрольну групу складали інтактні тварини, що знаходилися в аналогічних умовах. Кожні 2-3 дні (для уточнення дозування досліджуваних засобів), а також наприкінці експерименту визначали масу тіла у всіх тварин. Досліджувані сполуки вводилися перорально в дозі 0,01 ДЛ50. Одна сполука досліджувалась на 3-5 щурах. На 11-й день тварин виводили з експерименту під ефірним наркозом методом миттєвої декапітації. Антитиреоїдну активність оцінювали за рівнем трийодтироніну (Т3) і тетрайодтироніну (тироксину, Т4) у крові. Концентрацію тиреоїдних гормонів визначали методом радіоімунологічного аналізу (РІА) за допомогою наборів "Ріо-Т3-ПГ Мінськ" і "Ріо-Т4-ПГ Мінськ" (Інститут біоорганічної хімії АН Бєларусі). Принцип РІА засновується на взаємодії антитіла з антигеном, при якому в один з компонентів вводиться радіоактивна мітка. Радіоактивність проб підраховували на лічильнику "Наркотест-2" [139]. Конце