РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика експериментальних моделей та методів дослідження гормонально-месенджерної регуляції водно-сольового обміну і гемостазу
Для вирішення поставлених задач проведені серії експериментів та in vivo. У роботі використано 700 самців та самок білих щурів з середньою масою тіла 0,193(0,018 кг. Дослідження проводили через 6 тижнів після введення хлористих сполук кадмію і свинцю в період розвитку поліорганних та системних порушень [133].
При дослідженні впливу ангіотензину II на систему регуляції агрегатного стану крові ангіотензин II (Hуреrtensin, Ciba, Швейцария) вводили в яремну вену (1 мкг/хв на кг м.т.) на 0,9% розчині натрію хлориду. Збір сечі проводили за 120 хв. У сечі і плазмі крові визначали концентрації ?-тромбоглобуліну і 4 тромбоцитарного фактора, а також розчинних комплексів фібрин-мономера (у плазмі) і продуктів деградації фібрину (в сечі). Паралельно проводили модельні експерименти по вивченню продукції БТГ і ТФ4 in vitro за такою методикою. Інтактним щурам виконували водне або сольове навантаження. Через 2 год. під нембуталовим наркозом силіконованим шприцом з черевної аорти забирали 5,0 мл крові, стабілізуючи її натрію цитратом. Для отримання багатої на тромбоцити плазми кров центрифугували в силіконованих пробірках 5 хв. при 1000 об/хв. До 1,0 мл плазми додавали 0,2 мл тромбіну (1 од.) в суміші з СаС12. Після утворення фібринового згортка його осаджували центрифугуванням, плазму переносили в пластикові пробірки, додавали 100 од. контрикалу і зберігали при мінус 22 ?С до визначення БТГ і ТФ4.
В окремій серії дослідження для стимуляції або пригнічення плазмової РАС у щурів проводили дозовану крововтрату (взяття крові з яремної вени з розрахунку 2% від маси тіла) або розширення позаклітинного простору шляхом введення в яремну вену 0,9% розчину натрію хлориду в об'ємі 2% від маси тіла.
Оцінку стану гормональних систем регуляції водно-сольового обміну проводили на підставі радіоімунологічного визначення активності реніну плазми (SВ-RЕN-2, СIS International, Франція), активності ангіотензин-конвертуючого ферменту (Buhlmann Lab. AG., Швейцарія), концентрацій в плазмі крові ангіотензину II (Buhlmann Lab. AG., Швейцарія), альдостерону (SB-ALDO-2, CIS International, Франція), вазопресину (Buhlmann Lab. AG., Швейцарія), ?-передсердного натрійуретичного пептиду (Аlpha Rat Atrial Natriuretic Polipeptide, Peninsula Lab. Inc., США).
У тканині нирок радіоімунологічно досліджували вміст цАМФ, цГМФ (Сусlic АМР, Сус1iс GMP, Istitute for Research, Production and Аррliсаtions of Radioisitopes, Чехія), простагландину Е2 (Seragen Inc., США), простагландинів F2? і 6-КЕТО-F1?, тромбоксану В2 (Institute of Isotopes of Hungaruian Academy of Scinces, Угорщина), серотоніну (DRG International, США), ?-тромбоглобуліну і ТФ4 (Аbbott Lаb., Велика Британія).
Для визначення радіоактивності використовували комплекcи апаратури "Гамма-12", "Бета-1".
Екстракцію гормонально-месенжерних факторів із плазми крові і ниркової тканини проводили за інструкціями фірм, що додаються до наборів. Застосовували переважно твердофазовий метод екстракції: для оліго- і поліпептидних факторів - на мікроколонках С18, для ейкозаноїдів - на мікроколонках Аmprer С8 (Аmersham, Велика Британія), котрий дозволяє в невеликому об'ємі розчиннику отримати вихід до 80%. У якості елюантів використовували: для ангіотензину II і АДГ - етиловий спирт, передсердного натрійуретичного пептиду, циклічних нуклеотидів - 6% трихлороцтову кислоту, ейкозаноїдів - етилацетат.
2.2. Методи дослідження функціонального стану нирок
У всіх серіях досліди проводились за умов водного або сольового навантаження - під час напруги функцій нирок, спрямованих на збереження сталості внутрішнього середовища організму. це створює умови для виявлення прихованих порушень функцій нирок і визначення резервів їх компенсації. функціональний стан нирок визначали кліренс-методом оцінки діяльності судинно-клубочкового апарату та роздільної функції проксимального та дистального канальцевих відділів нефрона (при водному навантаженні) [122].
Водне або сольове навантаження проводили за 2 год до евтаназії: через металевий зонд вводили у шлунок підігріту до 30°с водогінну воду або 3% розчин натрію хлориду в об'ємі 5% від маси тіла тварин. сечу збирали протягом 2 год. по закінченні цього етапу досліду, здійснювали декапітацію щурів, яку проводили під ефірним наркозом. у момент декапітації тварин збирали кров в охолоджені центрифужні пробірки з гепарином, який використовувався як стабілізатор-антикоагулянт. кров центрифугували 30 хв при 3000 об/хв, відбирали плазму для визначення вмісту електролітів і креатиніну.
Концентрацію натрію і калію в сечі та плазмі крові визначали методом фотометрії полум'я на "фпл-1", креатиніну - за реакцією з пікриновою кислотою [12,107] з реєстрацією показників екстинції за допомогою фотоколориметра "кфк-2" і спектрофотометра "сф-46" [108]; білка в сечі - сульфосаліциловим методом за міхеєвою, богодаровою [114]. екскрецію креатиніну розраховували за його концентрацією в сечі: ecr=ucr х v, де ecr - екскреція, UCR - концентрація креатиніну в сечі, v - діурез. Аналогічно визначали екскрецію іонів натрію, калію та білка.
Визначення рн сечі здійснювали за допомогою мікробіоаналізатора "redelkys" (угорщина), вміст кислот і аміаку в сечі - методом титрування [142]. аналіз і розрахунок функцій нирок проводили за відомими методами [122].
Для оцінки канальцевого транспорту іонів натрію розраховували абсолютну і відносну його реабсорбцію: rfna+ = ffna+ - ena+ та rna+ = [(ffna+ - ena+) : ffna+] x 100%, де ena+ - екскреція і ffna+ - фільтраційний заряд натрію.
Швидкість клубочкової фільтрації (ШКФ) розраховували за кліренсом ендогенного креатиніну: GFR = (V x Ucr) : Pcr, де GFR - ШКФ, V - об'єм сечі, Ucr - концентрація креатиніну в сечі, Pcr - в плазмі крові.
Здатність нирок концентрувати та розводити