Глава 2. Материалы и методы исследований
Исследовали консервированную кровь группы 0(I) доноров-мужчин в возрасте 20-36
лет в контейнерах из поливинилхлорида с гемоконсервантами «ЦФДА-1» производства
ZPSM «RAVIMED», Польша (320 образцов), «Адглюфоцит» («АГЦ») производства
Луганской фармацевтической фабрики НПП «Фармация» (160 образцов), и «Глюгицир»
(«ГГЦ»), производства производства ОАО «Синтез», Россия (160 образцов), с
первого по сорок второй день хранения при температуре (6±2)0С, с временными
промежутками в 7 суток (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Рецептура гемоконсервантов
Компонент
Количество, г
ГГЦ
ЦФДА-1
АГЦ
Натрия цитрата дигидрат
20,0
26,3
16,0
Лимонной кислоты моногидрат
3,23
Глюкозы моногидрат
30,0
31,9
30,0
Натрия фосфат одноосновной
2,22
5,0
Аденин
0,275
0,3
Вода для инъекций
до 1000 мл
до 1000 мл
до 1000 мл
Выбор возраста, пола и группы крови (с наименьшим содержанием эритроцитарных
антигенов) доноров осуществляли с целью максимальной стандартизации испытуемых
образцов консервированных эритроцитов.
Условием нашего исследования процессов альтерации и гибели эритроцитов было
сохранение последних не в изолированной из крови клеточной фракции, а в
консервированной крови, создающей максимальную возможность сохранения их
нативности на этапах хранения при позитивной температуре. Не отрицая то, что в
такой крови ряд естественных свойств дестабилизирован (подавлена система
свертывания за счет антикоагулянта, входящего в состав гемоконсерванта, нарушен
естественный реологический статус за счет отсутствия взаимодействий с
сосудистой стенкой), мы все же предполагали, что в таких условиях ряд
биохимических/биофизических процессов (например, кислородзависимые
окислительные процессы, агрегация клеток, осуществление антиоксидантной защиты
и пр.) должны сохраниться в условиях, приближенных к естественным.
Разделение консервированной крови на клеточную массу и плазму проводили с
использованием центрифуги РС-6 в соответствии с «Инструкцией по
фракционированию донорской крови на ее компоненты (плазма, эритроциты,
тромбоциты, лейкоциты) и их консервированию», утвержденной приказом МЗ Украины
№ 164 от 05.07.1999 г, и центрифуги лабораторной T23D (Германия).
Для исследования внутриклеточных показателей эритроциты, выделенные из крови,
заготовленной с использованием указанных гемоконсервантов, отмывали трехкратно
0,9% раствором натрия хлорида. С помощью автоматического гематологического
анализатора АВХ Micros 60 OT 18 (Франция) и параллельно с использованием камеры
Горяева подсчитывали количество клеток в 1 мл каждого опытного образца и
доводили до 6,5±0,5·1012/мл 0,9% раствором NaCl.
Для исследования внеклеточных показателей использовали плазму,
фракционированную из крови, заготовленной на вышеуказанных гемоконсервантах.
Для изучения морфологии и оценки морфометрических изменений эритроцитов
консервированной крови на этапах хранения использовали автоматический
гематологический анализатор АВХ Micros 60 OT на 8 параметров, включающих
количество эритроцитов (RBC), уровень гемоглобина (Hb), гематокрит (Ht),
средний объем эритроцитов (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроците
(MCH), средняя концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), анизоцитоз
эритроцитов, гистограммы распределения эритроцитов.
Морфологические исследования эритроцитов осуществляли также в нативных
препаратах и мазках, приготовленных по унифицированной методике, окрашенных по
Романовскому и Крюкову-Паппенгейму, с использованием светового микроскопа
Биолам ЛОМО Р1У42. Для выявления телец Гейнца-Эрлиха эритроциты окрашивали 2%
раствором метилвиолета в изотоническом растворе натрия хлорида;
Для определения количества мертвых и живых эритроцитов использовали также
биохимический набор «Apoptosis Detection Kit, Annexin V-CY3», содержащий
6-Carboxyfluorescein diacetate (6-CFDA) и Annexin-Cy3.18 (AnnCy3).
Предположили, что предварительная обработка клеток указанными красителями
позволит пометить первой меткой функционирующие, а второй – мертвые эритроциты,
поскольку AnnCy3 не проникает через мембрану живых клеток, а 6-CFDA, напротив,
накапливается в них [27].
Красную флюоресценцию эритроцитов при освещении лазером оценивали как признак
связывания AnnCy3 с фосфатидилсерином, присутствующим на внешней стороне
плазматической мембраны клеток, подверженных апоптозу. Применение 6-CFDA было
обусловлено тем, что данное не флюоресцирующее вещество легко входит в живую
клетку. Далее образующийся при ее метаболизме пероксид водорода при участии
клеточных ферментов – эстераз взаимодействует с 6-CFDA, образуя флуоресцирующее
в зеленой области спектра окисленное производное 6-CF. Таким образом, получили
зеленый сигнал жизнеспособных клеток. Количественно оценили долю разных
субпопуляций клеток в суспензии эритроцитов путем одновременного внесения в
суспензию эритроцитов двух указанных меток.
Погибшие эритроциты изучали при помощи люминесцентного микроскопа Olympus AX70.
Окрашивание отмытых трижды эритроцитов в нативном препарате производили
красителем люминесцентным Fits Lucifer yellow, инкубируя клетки в течение 15
минут при 370C в PBS, содержащем1 мг/мл красителя, затем трижды отмывали PBS и
анализировали, используя светофильтр с диапазоном длины волны 460-490 нм.
Вязкость консервированной крови, вязкость плазмы определяли с помощью
капиллярного вискозиметра [319] при температуре +250±10С. Постоянная
температура достигалась термостатированием проб.
Процесс агрегации эритроцитов оценивали методом прямой микроскопии
консервированной крови c вычислением коэффиц
- Київ+380960830922