Розділ 2. Матеріали та методи досліджень
2.1. Матеріали досліджень
Об'єктом досліджень були: головний мозок, плазма й сироватка крові білих
лабораторних щурів та щурів лінії Вістар різного віку: 1,6,12,18 - добових
щурят - статевозрілих щурів, вага яких відповідно коливалась від 2 до 250 г.
Після декапітації з головного мозку контрольних та дослідних щурів виділяли
наступні структури: кору великих напівкуль, гіпокамп, смугасте тіло, мозочок,
середній мозок та варолієв міст, із яких отримували білкові фракції для
визначення в них концентрації ГФКБ. Усі операції при роботі з мозком виконували
при 0оС.
Для отримання очищеного препарату ГФКБ використовували 50 г білої речовини
мозку (аутопсійний матеріал жертв нещасних випадків).
Кров відстоювали 1 годину при кімнатній температурі та центрифугували 20 хвилин
при 3000 об/хв. Сироватку крові використовували для визначення вмісту ГФКБ.
2.2. Експериментальні моделі дії іонізуючого випромінювання
На основі літературних даних представляється актуальним і доцільним дослідження
впливу малих доз радіації на мозок людини й тварини [253,254,255,256]. Вибрані
дози опромінення в певній мірі нагадують про рівень опромінення деяких груп
учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС [257]. Тим більш, що до кінця
1986 року в 30 кілометровій зоні діяла гранично допустима доза аварійного
опромінення 0,25 Гр [258].
2.2.1. Умови проведення одноразового тотального рентгенівського опромінення
щурів.
Експерименти були проведені на білих лабораторних щурах 3 місячного віку масою
140-160 г. Щурів ділили на дві групи – псевдо-опромінену контрольну (n=12) і
дослідну (n=30). Дослідну групу тварин піддавали рентгенівському опроміненню в
дозі 0,25 Гр одноразово на установі РУМ-17 (напруга 150 кВ, сила струму 6 мА,
фільтри Сu 2+ Cu 0,5 мм, фокусна відстань 186 см, потужність дози 0,26 cГр/хв).
Щурів декапітували через 1, 12, 24, 120 і 168 годин після опромінення.
2.2.2. Умови проведення фракціонованого тотального рентгенівського опромінення
щурів.
Для з’ясування ефективності фракціонованої дії опромінення у дозі 0,25 Гр на
реорганізацію проміжних філаментів астроцитів головного мозку щурів опромінення
проводили за наступною схемою.
Процедура включала в себе три послідовних етапи. На першому етапі дослідну
групу тварин піддавали фракціонованому опроміненню по 0,01 Гр на добу протягом
25 діб (сумарна доза 0,25Гр) на установі РУМ-17 (напруга 150 кВ, сила струму 6
мА, фільтри Сu 2+Cu 0,5 мм, фокусна відстань 186 см, потужність дози 0,26
сГр/хв).
Другий етап уключав у себе 2-х тижневу перерву, після якої щури
псевдо-опроміненої контрольної й дослідної груп спаровувалися для отримання
нащадків згідно наступної схеми:
контрольна самка + контрольний самець (контрольна група);
опромінена самка + опромінений самець (І група);
опромінена самка + контрольний самець (ІІ група);
контрольна самка + опромінений самець (ІІІ група).
На третьому етапі нащадків щурів І покоління декапітували на 6, 9, 12, 18 добу
постнатального розвитку.
2.3. Експериментальне моделювання гемічної гіпоксії
З метою оцінити метгемоглобін-формуючий вплив іонізуючого опромінення на
систему проміжних філаментів астроцитів нами моделювалася гемічна гіпоксія, яку
створювали використовуючи нітрит натрію - класичний метгемоглобінутворювач
[259]. Нітрит натрію вводився інтраперитонально з 5 по 19 день вагітності
самкам у вигляді 2% NaNO2, приготовленого на фізіологічному розчині [260].
Загальна кількість NaNO2 складала 900 мкг на 1 кг ваги тварини. Контрольним
самкам вводили фізіологічний розчин в еквівалентному об`ємі. Щурят, отриманих
від контрольних і гіпоксичних самок, декапітували на 1, 6 і 12 днів
постнатального розвитку. Ступінь гіпоксії тестували по концентрації
метгемоглобіну в крові самок і їхніх нащадків за методом. Евелліна і Меллоя
[261].
2.4. Експериментальна модель пренатального стресу
Для вивчення можливих механізмів, зв'язаних із стресовим впливом іонізуючого
опромінення нами проводилося cтресування вагітних самок у другій половині
вагітності, використовуючи тест «змушеного плавання» [262]. Тварини плавали
протягом 10 днів у стандартній ванні (висота води 35-37 см) при температурі
води +18оС. Тривалість процедури складала 2 години.
2.5. Методи виділення та очистка ГФКБ
Для виділення та очистки ГФКБ використовували аутопсійний матеріал жертв
нещасних випадків через 8-12 годин після загибелі. Перший етап очистки полягав
в отриманні фракції збагаченої розчинною формою ГФКБ мозку шляхом
диференційного центрифугування (рис.2.1) [263,264].
Отриману фракцію збагачену розчинною формою ГФКБ використали для подальшої
очистки ГФКБ. Наступний етап очистки ГФКБ включав у себе адсорбційну
хроматографію [265], яку проводили з використанням гідроксилапатиту (“Sigma”,
USA) та осадження 30% сульфатом амонію.
10 г білої речовини мозку гомогенізували в 40 мл
0,005 М натрій-фосфатного буферу, рН 8,0, що містить
2 мМ етілендіамін-тетраоцтова кислота (ЕДТА), 2 мМ b-меркаптоетанол, 0,2 М
фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ).
центрифугування при 50000 g на
протязі 60 хвилин
Р1 S1 + 15 мл 0,2 М натрій-ацетатній буфер
рН 3,6, доведення рН 4,7
центрифугування при 50000 g
впродовж 60 хвилин
S2 P2 + 20 мл натрій-фосфатного буферу,
рН 8,0, що містить 2 мМ ЕДТА
центрифугування при 50000 g на
впродовж 60 хвилин
Р3 S3 - фракція збагачена розчинною