ГЛАВА 2
Материалы и методы исследований
Для исследования использовали эритроциты, полученные из донорской крови, заготовленной на глюгицировом консерванте. Кровь II-ой группы была предоставлена областной станцией переливания крови г Харькова. После удаления плазмы эритромассу дважды отмывали путем центрифугирования при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме физиологического раствора (0,15 Моль/л NaCl, 0,01 Моль/л фосфатный буфер, pH 7,4) и хранили в виде плотного осадка не более двух часов при температуре 0?С. Лейкоцитарную пленку удаляли аспирацией. Все использованные в работе среды готовили на 0,01 Моль/л фосфатном буфере, рН 7,4.
Гипертоническое воздействие осуществляли перенесением равных аликвот суспензии контрольных клеток и клеток, подвергшихся предварительной дегидратации в умеренно гипертонических растворах, в 1 мл высококонцентрированного раствора NaCl (2,0, 3,0 или 4,0 моль/л), гематокрит 0,4%. Перенесение и экспозицию эритроцитов в гипертонической среде осуществляли при заданной температуре (0 или 37?С). Далее целые клетки осаждали центрифугированием при 1500g в течение 3 мин. Количество гемоглобина в супернатанте определяли спектрофотометрически. По 50 мкл осадка эритроцитов переносили в 0,5 мл раствора NaCl (0,15, 0,45, 0,7 моль/л) при заданной температуре (0 или 37?С) и инкубировали две минуты (этап предварительной инкубации). Затем из каждой пробы по 50 мкл суспензии эритроцитов переносили в 1,0 мл раствора, содержащего 4,0 Моль/л NaCl (контроль), или в 1,0 мл 4,0 Моль/л раствора NaCl, содержащего амфифильное вещество. Пробы центрифугировали и 1мл супернатанта смешивали с 1мл ммоль/л Na-фосфатного буфера, рН 7,4+0,2% тритон Х-100 для предупреждения возможного высаливания гемоглобина из раствора, а также для удаления микровезикул, вносящих существенные искажения в показания спектрофотометра из-за сильного рассеивания света.
Для регистрации динамики гипертонического гемолиза эритроцитов в работе была использована установка для измерения малоуглового светорассеяния (расходимость пучка 3?) клеточных суспензий, созданная на основе монохроматора СФ-4А. Описание метода анализа клеток, основанном на измерении рассеяния света, представлено в работах [ ].
Уровень гемолиза эритроцитов как функцию времени определяли путем регистрации изменения во времени оптической плотности суспензии эритроцитов (длина волны 720 нм). Концентрация суспензии эритроцитов в кювете составляла (1,7-3,5)?106 кл/мл. В рассматриваемом концентрационном диапазоне оптическая плотность клеточной суспензии прямо пропорциональна количеству интактных клеток. Светорассеяние теней, образующихся в процессе лизиса эритроцитов, и поглощение света гемоглобином при указанной длине волны пренебрежимо малы.
При исследовании гипертонического криогемолиза эритроцитов охлаждение проводили переносом пробирок из 37 в 0?С (со средней скоростью 1-1,2 град/мин) или вливанием пробы в охлажденный раствор (разведение в 10-15 раз) при 0?С. В ряде экспериментов проводили модификацию температурных условий путем сдвига температуры, например в цикле 0-0-37-0?С. Эритроциты на предварительном этапе помещались в исследуемую среду при 0?С, затем переносились в гипертонический раствор с определенной тоничностью, затемпробы нагревались до 37?С на водяной бане, инкубировались 10 минут и охлаждались на ледяной бане (0?С) в течение 10 мин.
Обработку эритроцитов осуществляли следующим образом: фуросемид и салициловую кислоту добавляли к суспензии клеток (10% гематокрит) в концентрации 10 и 15 ммоль/л в соответственно виде раствора в 0,15 моль/л NaCl при 37?С на 10 мин, SITS при 37?С на 1-30 мин, в концентрации 5 ммоль/л. Обработанные клетки осаждали центрифугированием и хранили в виде плотного осадка не более 20 мин.
В экспериментах по исследованию гипертонического шока и постгипертонического криогемолиза конечный гематокрит суспензии составлял 0,4%. Исследуемое вещество добавляли в литическую среду перед внесением клеток. Постгипертонический криогемолиз оценивали перенося 50 мкл осадка эритроцитов в 0,5 мл раствора NaCl (1,2 моль/л) на 10 мин при последующей температуре. Затем из этой пробы 50 мкл суспензии эритроцитов переносили в конечный раствор NaCl. Клетки осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 1500g. Содержание вышедшего в супернатант гемоглобина определяли спектрофотометрическим способом на СФ-4А с проточной кюветой при длине волны 543 нм. За 100 % принимали поглощение пробы, в которую добавляли детергент тритон Х-100 в концентрации 0,2%. Каждый эксперимент повторяли не менее 6 раз в двух параллельных пробах. Сохранность эритроцитов определяли как разницу между 100% гемолизом в присутствии детергента и величиной гемолиза в каждой экспериментальной пробе.
Модификацию клеток амфифилами осуществляли при различных температурах эксперимента в интервале 0-37?С. На этапе предварительной инкубации клеток в физиологической среде эритроциты вносили в раствор, содержащий амфифилы при соответствующей температуре инкубации. В части экспериментов амфифилы добавляли на различных этапах инкубации клеток. Супернатант удаляли, клетки использовали в дальнейших экспериментах. На этапе предварительной дегидратации и на этапах собственно гипертонического шока амфифильное вещество присутствовало в солевой среде в указанной концентрации.
Обработку эритроцитов диамидом проводили по следующему методу. Суспензию эритроцитов (гематокрит 4%) инкубировали в физиологическом растворе (0,150 моль/л NaCl, 0,010 моль/л фосфатный буфер, рН 8,0) с диамидом в указанной концентрации при температуре 37?С в течение 45 мин в условиях постоянного перемешивания. По окончании времени инкубации клетки трижды отмывали от диамида раствором, содержащим 0,150 моль/л NaCl, 0,010 моль/л фосфатный буфер, рН 7,4, и использовали в дальнейшем в экспериментальной работе. Контролем служили эритроциты, подвергшиеся аналогичным воздействиям в отсутствии сульфгидрильного реагента.
Обработку эритроцитов гемином проводили по
- Київ+380960830922