РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Загальна характеристика проведених досліджень.
Експериментальнi дослiдження проводили на базі лабораторії модифiкацiї структури бiлогiчно активних речовин ІМБіГ НАНУ. Окремi вірусологічні дослiдження проводилися в лабораторiї контролю якості імунобіологічних препаратів Інституту епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України.
Пiд час роботи використовували iзатізон, виготовлений в умовах лабораторії МСБАР ІМБіГ НАН України (патент України №1780, 1994, ТУ У 46.15 -341-98) [127], чистота продукту доведена методами хімічного аналізу.
Тварини. В дослідах використовували експериментальних мишей ліній СВА, Balb/c, C57B1/6, (CBA х C57B1/6)F1 із віварію ІМБіГ НАН України, курчата "бройлер-6" 30-денного віку - з Білоцерківської птахофабрики.
Культури клітин еритромієлоїдної лінії К-562, лімфосаркоми щурів ЛСК, одержані з клітинного банку ліній з тканин людини та тварин, (науковий керівник д.б.н. Ю.Й.Кудрявець, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.С. Кавецького, НАН України). Культуру клітин Vero (клітини нирки зеленої мавпи), міелолейкозні клітини мишей СТLL-2 та JAK-1 люб'язно надані к.б.н О.В Свіріщевською (Інститут біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна, НАН Росії) .
Для глибшого розуміння процесів, які відбуваються під впливом ізатізону в клітині і в організмі, використовували моделі in vivo та in vitro. Дослідження були спрямовані на вивчення реакцій, які викликає препарат на рівні специфічного та вродженого імунітету.
2.2. Одержання очищених лімфоцитів.
Для визначення функціональної активності лімфоцитів використовували загальноприйнятий метод їх очищення шляхом центрифугування при 1500 об/хв- протягом 30 хвилин з використанням градієнту щільності фікол-верографін (питома щільність 1,077 г/см3) (Фікол 400 фірми "Pharmacia Fine Chemicals", Швеція; верографін - "Спофа", Чехія) в стерильних умовах. Після відмивання шляхом центрифугування у ЗФР при 1500об/хв- протягом 10 хвилин клітини розводили середовищем RРМІ-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% ЕТС, 2 мМ L-глютаміна, 50 мкМ 2-меркаптоетанола та 20 мкг/мл гентаміцина. Кількість загиблих клітини визначали при допомозі фарбування 0,02% розчином трипанового синього ("Fluca", Швейцарія). Чистота і життєздатність виділених клітин складала 97-98% [130].
2.3. Культивування клітин.
Культури клітин культивували в атмосфері 5% СО2 при 370 С у повному поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma,США) із 10% інактивованою телячою ембріональною сироваткою (ЕТС), 2 мМ L-глютаміна, 50 мкМ 2-меркаптоетанола та 50 мкг/мл гентаміцина. Лінію CTLL-2 підтримували додаванням у середовище 50 од/мл pекомбінантного IЛ-2. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою фарбування їх 0,02% розчином трипанового синього ("Fluca", Швейцарія) [131].
2.4. Аналіз структурно-конформаційних особливостей метисазону та прототропної таутомерії ізатіну.
Для характеристики біологічної активності молекули метисазону, і її головної частини - ізатіну, ми скористалися напівемпіричними квантово-хімічними методами АМ1 та МNDO/H, які добре зарекомендувли себе для вирішення подібного кола задач і об'єктів.
Методом АМ1 в режимі оптимізації всіх структурних параметрів досліджували мінімуми гіперповерхні потенціальної енергії (ГППЕ) молекули, що відповідають її конформаціям, а методом МNDO/H вивчали наявність внутрішньомолекулярних водневих зв'язків як конформаційно-стабілізуючих чинників. Коливальні спектри розраховували у гармонійному наближенні методом АМ1 [128,129].
2.5 Противірусна дія препарату ізатізон на моделі герпесвірусної інфекції ВПГ-1.
Досліди проводились на базі лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів НДІЕіІХ ім. Л.В.Громашевського, АМН України (зав лаб. д.м.н. С.Л Рибалко.)
При роботі з вірусом in vitro використовували культуру клітин Vero 150-200 тис.кл/мл, культивовану на поживному середовищі 199+Ігла (1:1) з дадаванням інактивованої 10% ЕТС, антибіотиків. Використовували ліофілізований вірус герпеса простого 1 типу (ВПГ-1), штам VC. Інфекційний титр ВПГ в культурі клітин Vero становив 6,5 -7,0 lg ТЦД50/0,1 мл. Визначали токсичність, максимально переносиму концентрацію та хіміотерапевтичний індекс препарату по відношенню до вірусу герпесу шляхом співвідношення максимально переносимої концентрації до мінімально активної концентрації препарату.
Для вивчення протигерпетичної дії препарату ізатізон було використано модель герпетичної інфекції (герпетичний менінгоенцефаліт). Така модель зручна для оцінки виразності симптоматики, вирізняється 100% відтворенням і не вимагає застосування додаткових контролей. Розвиток клінічних симптомів захворювання в контролі починається на 5-6 добу після інфікування і сягає максимума на 13-14 добу. [132, 133]
Референс-препаратом було взято ацикловір - ациклічний нуклеозид (синонім - віролекс) у вигляді натрієвої солі ("КRКА", Словенія), який являє собою дефектну основу для утвореня хибної ланки ланцюга вірусної ДНК, від чого вірус втрачає здатність до реплікації. Препарат не токсичний, але через високу вартість не може широко застосовуватися в клінічній практиці України. В дослідах використовували білих безпордних мишей вагою 14-16 г. Вивчали профілактичну та лікувальну дію ізатізону в системі in vivo в таких варіантах досліду:
1 - миші, яким вводили ізатізон + вірус герпеса
2 - миші, яким вводили віролекс + вірус герпеса
3 - миші, яким вводили фізіологічний розчин + вірус герпеса
До інфікування - профілактична схема введення; через 24 год після зараження вірусом герпеса - лікувальна схема.
За тваринами спостерігали і відмічали клінічні ознаки інфекційного процесу методом гістологічного спостереження мозку, печінки, селезінки. Аналіз наявності вірусного антигену проводили за допомогою імунолюмінесцентного методу. Світіння (+ або ++) відмічалося в селезінці, а в печінці воно було з