РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ I МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Згідно поставлених задач було проведено експериментальні дослідження in vitro,
експериментальні дослідження на піддослідних тваринах і клінічні дослідження.
Зміст та об’єм проведених досліджень представлені у табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Групи експериментальних і клінічних досліджень
Мета дослідження
Основна група
Контрольна група
Експериментальні дослідження in vitro
Вивчення бар’єрної функції АО для запальних клітин
20 проб
Експериментальні дослідження на кроликах
Розробка експериментальної моделі неінфекційної виразки рогівки
10 кроликів (20 очей)
Вивчення реакції рогівки на інтерламелярну трансплантацію АО
5 кроликів
(5 очей)
5 кроликів
(5 очей)
Експериментальне вивчення ефективності ТАО при модельованій неінфекційній
виразці рогівки
26 кроликів
(26 очей)
26 кроликів
(26 очей)
Гістоморфологічне вивчення інфільтрації рогівки запальними клітинами при
експериментальній виразці рогівки
12 очей
(36 препаратів)
12 очей
(36 препаратів)
Клінічні дослідження
Вивчення ефективності ТАО при неінфекційних виразках рогівки різної етіології
28 хворих
(30 очей)
30 хворих
(30 очей)
Біохімічні дослідження у клініці
Визначення вмісту СОД, каталази, глутатіонпероксідази, ЛДГ, МДГ у сльозі
хворих
14 хворих до та після лікування
(14 очей)
9 здорових добровольців
(18 очей)
2.1. Експериментальні дослідження
2.1.1. Вивчення бар’єрної функції АО для запальних клітин in vitro.
З метою патогенетичного обґрунтування застосування АО у хірургічному лікуванні
неінфекційних виразок рогівки проводилося вивчення бар’єрної функції АО для
запальних клітин in vitro.
Експеримент проводили в стерильних умовах в інкубаторі з постійним 5% вмістом
СО2.
У пробірку з живильним середовищем (RPMI-1640, гентаміцин 10мг/1мл бідистіляту,
10% ембріональна теляча сироватка) поміщали запальні клітини – Т-лімфоцити
(Jurkat) в концентрації 1млн/1мл. До складу RPMI-1640 входять наступні
компоненти:
Компоненти
г/л
Компоненти
г/л
L-Arginine [Free Base] 0.2
L- Asparagine [An.hydrous] 0.05
L-Aspartic Acid 0.02
L-Cystine • 2HCI 0.0652
L-Clutamic Acid 0.02
L-Clutamine 0.3
Glycine 0.01
L-Histidine [Free Base] 0.015
Hydroxy-L-Proline 0.02
L-Tyrosine • 2Na • 2H20 0.02883
L-Valine 0.02
Biotin 0.0002
Choline Chloride 0.003
Folic Acid 0.001
myo-lnositol 0.035
Niacinamide 0.001
D-Pantothenic Acid Hemicalcium 0.00025
PABA 0.001
Pyridoxine • HCI 0.001
Riboflavin 0.0002
L-lsoleucine 0.05
L-Leucine 0.05
L-Lysine • HCI 0.04
L-Methionine 0.015
L-Phenylalanine 0.015
L-Proline 0.02
L-Serine 0.03
L-Threonine 0.02
L-Tryptophan 0.005
Thiamine • HCI 0.001
Vitamin B12 0.000005
Calcium Nitrate • 4H20 0.1
Magnesium Sulfate [Anhydrous] 0.04884
Potassium Chloride 0.4
Sodium Chloride 6.0
Sodium Phosphate Dibasic [Anhydrous] 0.8
D-Glucose 2.0
Glutathione, Reduced 0.001
Phenol Red • Na 0.0053
АО була заготовлена в лабораторії консервації тканин в стерильних умовах і
зберігалася в морозильній камері при температурі -70° С. Амніотичною оболонкою
закривали отвір пробірки і щільно фіксували її. Пробірку перевертали і
розміщували таким чином, щоб АО знаходилася в посудині з живильним середовищем.
З однієї сторони амніотичної оболонки у пробірці знаходилися запальні клітини в
живильному середовищі, з іншої – чисте живильне середовище такого ж об’єму
(рис. 2.1).
Оцінку проникності запальних клітин через АО проводили через 24 та 36 годин.
Для якісної оцінки вміст живильного середовища досліджували на присутність
запальних клітин з допомогою імерсійної мікроскопії. Експеримент проводився у 2
серіях у різні дні. Кількість пробірок становила 5 шт. – всього 20 проб.
2.1.2. Вивчення реакції рогівки на інтерламелярну трансплантацію амніотичної
оболонки в поверхневі шари рогівкової строми в експерименті.
Дослідження були проведені на 10 очах 5 кроликів породи шиншила віком 6-8
місяців масою 2,5-3 кг.
Інтерламелярну ТАО проводили на 5 очах 5 піддослідних тварин. Для цього під
епібульбарною анестезією 0,25% розчину дикаїну на відстані 2 мм від лімбу
проводили лезом розтин поверхневих шарів рогівки на 1/3 її товщини довжиною
6мм. Око фіксували пінцетом за верхній прямий м’яз. Круглим ножем проводили
розшарування рогівки розмірами 6x6 мм. В розшаровану рогівку з допомогою
шпателя заправляли трансплантат АО розмірами 5x5 мм.
Контрольну групу склали парні очі цих кроликів. В контрольній групі проводили
розшарування рогівкової строми цим же методом розмірами 6x6 мм. Після
проведення операції в основній і контрольній групах проводили одноразову
інстиляцію антибактеріальних крапель (0,25% розчин левоміцетину).
Критеріями оцінки реакції ока на трансплантат АО служили наявність і ступінь
роздратування ока, перикорнеальної ін’єкції, запальної реакції, набряку рогівки
та райдужки. Для оцінки цих явищ проводили біомікроскопію переднього відрізку
ока, флюоресцеїнову пробу, дослідження у прохідному світлі. Спостереження
проводили на протязі 1 місяця.
2.1.3. Розробка експериментальної моделі неінфекційної виразки рогівки.
З метою достовірного експериментального вивчення ефективності ТАО при
неінфекційних виразках рогівки розроблялася експериментальна модель
неінфекційної виразки рогівки, яка повинна характеризуватися стандартністю,
тривалим і торпідним перебігом, сповільненими регенерацією рогівкової строми і
епітелізацією рогівки.
Модель неінфекційної виразки рогівки розробляли на 20 очах 10 кроликів. Для
цього після епібульбарної анестезії 0,25% розчин