РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА методи досліджень
Визначення та вивчення імуномодуляторних властивостей молекулярного комплексу
дріжджова РНК – тилорон (МК) проводили, виходячи з експериментальних даних щодо
імунологічної реактивності дослідних тварин, а також дослідів in vitro.
Особливості впливу МК на формування імунної відповіді визначали в
експериментальних моделях на мишах. Здатність МК безпосередньо впливати на
клітини імунного захисту визначали in vitro за зміною функціональної активності
лімфоцитів, нейтрофільних гранулоцитів та моноцитів периферичної крові людей.
2.1. Об’єкт дослідження
В дослідах in vivo використовували лабораторних тварин – 585 мишей, в т.ч. 455
СВА, 50 Ваlb/c та 80 безпородних з віварію Інституту молекулярної біології і
генетики НАН України. Для вивчення in vitro впливу МК на функціональний стан
клітин імунного захисту людини використовували кров 0 (І) групи 20 здорових
донорів – волонтерів віком від 18 до 35 років: 10 жінок та 10 чоловіків.
2.1.1. Характеристика досліджуваних препаратів
Молекулярний комплекс РНК-тилорон (МК). МК утворюється при взаємодії
одноланцюгової дріжджової РНК з 2,7-біс[2-(диетиламіно-етокси)-флуорен]-9-он
дигідрохлоридом (тилороном) і вважається одним з перспективних індукторів
ІФН-a/b напівприродного походження завдяки наявності в його складі рибози та
утворенню в структурі одноланцюгової РНК під дією тилорону чисельних
дволанцюгових ділянок [55, 56, 58]. У якості високомолекулярного компоненту МК
використовували комерційний препарат дріжджової РНК (рибосомальна фракція) (НПО
„Біохімреактив”, Олайна, Латвія), який додатково очищували потрійною фенольною
депротеїнізацією з подальшим осадженням етанолом за стандартною методикою [87].
Низькомолекулярним компонентом МК слугував синтетичний препарат
2,7-біс[2-(діетиламіно-етокси)-флуорен]-9-он дигідрохлорид (тилорон) („Sigma”,
США).
Приготування розчину МК потрібної концентрації здійснювали шляхом прямого
змішування відповідних розчинів тилорону і дріжджової РНК в буфері 0,01 М
трис-НСІ (рН 6,8) і 0,05 М NaCl у співвідношенні 1:10 (М:М).
В якості препаратів порівняння в дослідах in vivo використовували РНК в дозі
12,5 мг/кг, чистий тилорон в дозі 1,25 мг/кг та відомий індуктор ІФН-б/в
рибонуклеїнової природи – ридостин (дволанцюгова РНК дріжджів Saccharomyces
cerevisiae, НПО „Вектор”, Росія) в дозі 1,0 мг/кг.
Концентрації всіх розчинів контролювали спектрофотометрично, використовуючи
спектрофотометр CARRY-1E «VARIAN», Австрія) [55]. Отримані розчини МК з
заданими концентраціями перед використанням стерилізували фільтруванням крізь
мембранні фільтри з діаметром пор 0,22 мкм („Синпор”, Чехія) і зберігали в
замороженому стані.
Реактиви, що використовувались в роботі.
В роботі використовували Na-ЕДТА (версен) (“Serva”, Німеччина), трис основний
(оксиметил) амінометан (“Merck”, Німеччина), Фікол 400 (“Pharmacia Fine
Chemicasl”, Швейцарія), верографін 76% (“Спофа”, Чехія), трипановий синій
(“Fluka”, Швейцарія), фітогемаглютинін (ФГА, “Sigma”, США), ліпополісахарид
(ЛПС E.coli 0111, “Sigma”, США), конканавалін А (КонА, “Calbiochem”, США),
метилпараамінофенолсульфат (метол) (Київський завод „РИАП”, „Реахім”), агароза
(“Difco”, США), НСТ (нітросиній тетеразолій) („ДиаэМ”, Німеччина), розчин
Гепарину (25000 ОД в 5 мл, стерильний для ін’єкцій, “Nordmark”, Німеччина),
сироватка діагностична гемолітична рідка (ЗАТ “Харківське підприємство по
виробництву імунобіологічних та лікарських препаратів „Біолік”, Україна),
комплемент сухий (ЗАТ “Харківське підприємство по виробництву імунобіологічних
та лікарських препаратів „Біолік”, Україна), еритроцити барана (ЕБ) (кров
бараняча, ВАТ „Біофарма”, Україна), латекс (суспензія монодисперсна твердих
сферичних часточок меламіноформальдегідної смоли; діаметр часточок 1,1 – 1,2
мкм з відносним відхиленням не більше 5%, “Nordmark”, Німеччина), ефір для
наркозу стабілізований (Шостка, Україна), масло імерсійне для мікроскопії (НПФ
“Синбиас”, Росія), фарба-фіксатор Мая-Грюнвальда (Диахим-Гемистейн-М,
С.-Петербург, Росія), фарба Романовського-Гімза (Диахим-Гемистейн-М,
С.-Петербург, Росія)
Прості хімічні сполуки, що використовувалися в роботі (Табл. 2.1.), за
виключенням ряду зазначених випадків, застосовували без додаткової очистки.
Таблиця 2.1.
Прості хімічні сполуки, що використовувалися в роботі
Найменування
сполуки
Кваліфікація
чистоти
Додаткова
очистка
HCl
КOH
NaCl
NaCl 0,9%
Na2HPO4
NaH2PO4
Na2CO3Ч10H2O
NaHCO3
КН2РО4
FeCl3Ч6H2O
Цитрат натрію
Етанол, 96%
Льодяна оцтова кислота
Трихлороцтова кислота (ТХО)
Н2О2 3%
Глютаровий альдегід
ч.
х.ч.
ч.д.а.
аптечний
ч.д.а.
ч.д.а.
ч.
ч.
ч.д.а.
ч.
ч.д.а.
ч.
х.ч
ч.
аптечний
ч.д.а.
–
перекристалізація
перегонка
Для дослідження експресії рецепторів імунокомпетентних клітин використовували
CD-діагностикуми (Вітебський медичний університет, кафедра
алергології-імунології, Росія).
В дослідах з вивчення впливу МК на спонтанну та мітоген-стимульовану
проліферацію, використовували 3Н-тимiдин (питома активність 1924 кБк/мл, СП
“Iзотоп”, Росiя).
2.1.2. Поживні середовища для культивування клітин,
їх компоненти і добавки
Для вирощування і підтримання клітинних культур в роботі використовували
середовища: RPMI-середовище-1640 (“Sigma”, США), середовище 199
(Експериментальне підприємство по виробництву бактерійних і вірусних препаратів
НДІПВЕ ім. Чумакова РАМН, Росія), поживне середовище Ігла (Експериментальне
підприємство по виробництву бактерійних і вірусних препаратів НДІПВЕ ім.
Чумакова РАМН, Росія),
- Київ+380960830922