РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)
2.1. Общие замечания
Листья, цветочные бутоны и стебли Cussonia paniculata Eckl. et Zeih. были
получены из Ботанического сада Ботанического института РАН (г.
Санкт-Петербург).
ТСХ-контроль проводили на пластинках «Silufol» и высокоэффективных ТСХ
пластинках «Merck» 60F254. Препаративное разделение проводили на силикагеле L
(40-100 мк) и микросферическом силикагеле «Silpearl». Использовали следующие
системы растворителей: хлороформ-метанол-вода (100:40:7) – А, (100:30:5) – В;
хлороформ-метанол-25% аммиак (100:50:15) – С, (100:40:10) – D, (100:30:6) – Е,
(100:20:3) – F; хлороформ-метанол-вода (100:40:7) – G или (100:30:5) –Н с
добавлением 3-5% муравьиной кислоты непосредственно перед
хроматографированием).
Детектирование гликозидов и агликонов проводили 10% спиртовым раствором
фосфорновольфрамовой кислоты, а сахаров – кислым фталатом анилина с последующим
нагреванием хроматограмм.
ЯМР-спектры получены на приборе Bruker DRX-500 (500 МГц для 1Н и 125 МГц для
13С) в дейтеропиридине. Для двумерных экспериментов HSQC, HMBC, COSY, TOCSY и
ROESY при получении спектров использовали пакеты стандартных программ фирмы
«Bruker».
При выполнение экспериментов использовались реактивы и растворители класса
«чистые для анализа» фирмы «Реахим», а также дейтеропиридин (С5D5N), содержащий
99% атомов дейтерия, фирмы «Aldrich».
2.2. Химические методы
Полный кислотный гидролиз. Для определения агликонов 1 мг гликозида растворяли
в 0,2 мл смеси 2 н. водной H2SO4 и метанола (1:1) и нагревали при 100°С в
течение 2 ч. Агликоны экстрагировали хлороформом, органическую фазу промывали
водой до нейтральной реакции и анализировали ТСХ в системе
хлороформ-метанол-25% аммиак (F) в сравнении с известными образцами.
Для определения сахаров 1 мг гликозида нагревали с 1 н. СF3СООН в 0,2 мл
диоксана (получали смешением 0,1 мл диоксана и 0,1 мл 2 н. водного раствора
трифторуксусной кислоты) при 100°С в течение 2 ч. Гидролизат без обработки
анализировали по ТСХ в системе хлороформ-метанол-25% аммиак (D) с заведомо
известными образцами углеводов.
Щелочной гидролиз. 2 мг гликозида растворяли в 0,5 мл 10% раствора КОН в смеси
метанол-вода (1:1) и нагревали при 100°С в течение 2 ч, затем нейтрализовали
H2SO4 до слабокислой реакции (рН=5-6 по универсальной индикаторной бумаге).
Прогенины экстрагировали бутанолом, бутанольный слой промывали водой до
нейтральной реакции и проводили ТСХ анализ путем сопоставления с известными
образцами монодесмозидных гликозидов.
Аммонолиз. Раствор гликозида наносили на ТСХ пластинку и выдерживали в парах
аммиака в течение двух часов. Затем на пластинку вновь наносили исходный
гликозид и проводили сравнение хроматографической подвижности после
хроматографирования в системе хлороформ-метанол-вода (А).
Ферментативный гидролиз. Для ферментативного гидролиза использовали фермент,
выделенный из семян плюща, и фермент, выделенный из желудочного сока
виноградной улитки. Для проведения ферментативного гидролиза к водному раствору
гликозида добавляли ферментный препарат и выдерживали несколько часов (контроль
ТСХ системы А и В), а затем добавляли избыток метанола, денатурировали фермент
нагреванием (кипячением) и отделяли центрифугированием. Супернатант
анализировали ТСХ (система А) путем сравнения с образцами прогенинов
установленного строение, полученными ранее в нашей лаборатории.
Ацетилирование и дезацетилирование. Ацетилирование проводили путем добавления к
смеси гликозидов (206 мг см. п. 2.3.4.) 20 мл смеси уксусный ангидрид-пиридин
(1:1) и выдерживанием при 20єС в течение 12 ч [12] с последующим упариванием
досуха при добавлении бензола. Для дезацетилирования гликозид растворяли в 50
мл безводного метанола с добавлением каталитического количества металлического
натрия (0,1 мг на 100 мг ацетата). Далее раствор выдерживали при комнатной
температуре в течение 2 часов с постоянным контролем протекания реакции по ТСХ
(система А). После окончания реакции раствор нейтрализовали катионитом КУ-2 в
Н+-форме и упаривали досуха.
2.3. Выделение, очистка и разделение гликозидов из листьев, бутонов и стеблей
2.3.1. Выделение гликозидов из листьев. Высушенные листья Cussonia рaniculata в
количестве 56 г измельчили и обезжирили бензолом (3 по 100 мл), гликозиды
экстрагировали 80%-ным водным изопропиловым спиртом (4 по 150 мл). Упаривание
спиртового экстракта в вакууме дало 16 г сухого остатка. Остаток растворили в
250 мл бутанола, насыщенного водой, и промывали водой (3 по 100 мл).
Бутанольный слой упарили, получив 8,5 г очищенной суммы тритерпеновых
гликозидов. Общее содержание тритерпеновых гликозидов – 15,8% на сухую массу
листьев.
Очищенную сумму тритерпеновых гликозидов разделяли хроматографически на
силикагеле L при градиентном элюировании системой хлороформ-изопропиловый спирт
(6:1>1:1), насыщенной водой. В результате получили 12 фракций тритерпеновых
гликозидов: L-A – 0,2 г, L-В – 0,17 г, L-С – 0,450 г, L-D – 0,26 г, L-Е – 0,9
г, L-F – 0,57 г, L-G – 3,24 г, L-Н – 0,45 г, L-I – 1,81 г, L-J – 0,27 г, L-K –
0,27 г, L-L – 0,3 г, обозначенных в порядке элюирования из хроматографической
колонки (здесь и далее приставка L обозначает листья).
Гликозиды L-Е1 – 0,4 г и L-Е2 – 0,43 г были получены при разделении фракции L-Е
(0,9 г) с помощью препаративной хроматографии на микросферическом силикагеле
«Silpearl» при элюировании системой хлороформ-изопропиловый спирт (4:1),
насыщенной водой.
Фракцию L-G разделяли на микросферическом силикагеле «Silpearl» при элюировании
системой хлороформ-изопропиловый
- Київ+380960830922