ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСЛЕДОВАННЫХ БОЛЬНЫХ
2.1 Характеристика методов исследования
В процессе работы были использованы гематологические, цитологические и иммунологические методы исследования.
Материалом для гематологических методов служили образцы периферической крови детей с ожогами .
Взятие крови для подсчета эритроцитов и лейкоцитов осуществлялось общепринятым методом .
Для изучения показателей клеточного состава периферической крови у детей использовали следующие гематологические методы.
Определение содержания гемоглобина проводилось унифицированным гемиглобинцианидным методом. [95]. Определение среднего содержания гемоглобина в эритроците проводили путем деления концентрации гемоглобина в 1 мкл крови на число эритроцитов в том же объеме [95].Среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците вычисляли путем деления концентрации гемоглобина в г/100мл на гематокритную величину и умножения на 100 [95]. Определение осмотической резистентности (полный лизис) проводили по методу Идельсона [135]. Определение содержания ретикулоцитов проводили унифицированным методом после их окраски азуром II непосредственно на стекле (суправитальная окраска красителем, выявляющая зернисто-нитчатую субстанцию ретикулоцитов)[95]..
Взятие крови для подсчета лейкограммы осуществлялось по общепринятому методу. Окраска мазков проводилась по Паппенгейму. Подсчет лейкограмм производился на 200 клеток [95].
Лимфоциты выделяли из цитратной крови в градиенте плотности фиколл-верографин . В работе использовали фиколл (Pharmacia Fin chemicals, Швеция) и верографин (Споффа, Чехословакия).
Для исследования количественных и качественных характеристик лимфоцитов периферической крови нами использовались следующие методы.
Тест прямого и непрямого розеткообразования для индефикации Е- и ЕАС-РОЛ. Количество Е-РОЛ определяли общепринятым методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (ЭБ) после контакта (18 часов при +40С) лимфоцитов с ЭБ методом [61, 65]. Теофилинчувствительные (Е-РОЛтео.чувс.) и теофилинрезистентные (Е-РОЛтео.рез.) лимфоциты определяли по методу [95]. Подсчет розеток проводили в камере Горяева. Определение ЕАС-РОЛ проводили методом непрямого розеткообразования для выявления рецепторов к комплементу . Эритроциты, сенсибилизированные амбоцептором и "нагруженные" комплементом, связываются с мембраной лимфоцитов, содержащих рецепторы комплемента, с образованием розеток. Источником комплемента была сыворотка мыши
Пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови обследованных детей оценивали в реакции бласттрансформации (РБТл) [61]. Из каждого образца крови готовили семь культур лимфоцитов: с фитогемагглютинином (ФГА фирмы Дифко),с липополисахаридом (ЛПС) с тем же ФГА и ЛПС, но предварительно инкубированные с дексаметазоном и индометацином, и без митогена. Для культивирования лимфоцитов использовали Среду199. Оценка реакции производилась радиометрическим методом по включению 3Н-тимидина. Подсчет проб производили с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрофотометра SL (Франция) и результаты выражались числом импульсов в минуту с последующим определением индекса стимуляции (ИС). Исследования выполнялись с использованием оборудования радиологической лаборатории Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины.
Иммуноглобулины изотипов A, G, M в сыворотке крови детей определяли методом радиальной иммунодифузии в геле по Mancini et al [65 ]. Расчет содержания их в периферической крови проводился путем сравнения полученного радиуса иммунодифузии по стандартной логарифмической шкале.
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке периферической крови больных детей определяли методом, основанном на способности полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000Д при низких концентрациях (3,5%) преципитировать иммунные комплексы с последующим измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280нм, и выражали в условных единицах. В работе использовался ПЭГ (Loba chemil, Австрия)[95].
Для определения выраженности аутоиммунных реакций в работе были использованы следующие методы.
Количество лимфоцитов, образующих розетки с аутологичными эритроцитами, определяли методом аутологичного розеткообразования [95].
Определение киллерной активности лимфоцитов по отношению к аутологичным эритроцитам проводилось общепринятым методом в собственной модификации1. Оценка реакции производилась радиометрическим методом по количеству освобожденного Cr51 из клеток-мишеней (аутологичных эритроцитов) при помощи гамма - счетчика "Гамма - 10" (Россия). Результаты выражали в процентах по расчетной формуле:
проба - спонтанный лизис
% киллерной активности =-----------------------------
максимальный лизис
Исследования проводили с использованием оборудования радиологической лаборатории Киевской клинической больницы №9
Для изучения влияния сывороточных факторов на показатели активности лимфоцитов определяли содержание лимфоцитов, образующих розетки с аутологичными эритроцитами, а также активность лимфоцитов в киллерной реакции под влиянием цельной сывороткой крови и ее различных фракций. Удаление различных фракций из цельной сыворотки проводили методом высаливания сульфатом аммония 50% и 100% концентрации по общепринятой методике [95]. Удаление фракции, содержащей средне- и низкоразмерные соединения, осуществляли методом фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 100-250 нм.
Для изучения содержание неполных тепловых агглютининов в сыворотке крови детей с ожогами использовали метод агглютинации эритроцитов в солевой и желатиновой средах [134].
Для изучения цитолитической активности аутологичной сыворотки и ее различных фракций на собственные эритроциты больного использовали метод лейколиза [87].
2.2 Характери